核内のゲノムDNAとタンパクの相互作用をin situで可視化する技術の開発

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K14529
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 目野 主税 九州大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (20311764)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 発現制御 / タンパク質-DNA相互作用

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、特定のゲノムDNA領域と特定のタンパク質の相互作用をin situで検出する方法論の開発を目指している。これを成し遂げるために、抗体によるタンパク質の検出法とFluorescent in situ hybridization (FISH) 法を両立させ、これらが近接した時にだけ蛍光を発するような技術の開発を行っている。FISH法は特定のゲノムDNA領域に対するプローブをハイブリさせ、興味の配列の核内局在を調べる技術である。しかしながら、通常のFISH法を行った後に免疫染色でタンパク質を検出することはほとんど不可能である。その主な原因は、FISH法のハイブリ操作ではホルムアミドを用いた熱変性が必要であり、目的の抗原が認識されにくくなるためである。平成27年度は、培養細胞においてFISH法と免疫染色の両立を目指し、手法の見直しや、様々な改良をおこなった。その結果、まずチラミド増感法で抗原を標識し、その後に通常のFISH法を行った場合は、その標識を抗体で認識することができないが、proteinase Kで抗原を賦活化すると抗体で認識できることが分かった。特にハイブリと抗原賦活化の条件によって結果は大きく左右されるが、再現性良くFISH法と免疫染色を同時に行うための条件を見つけ出すことに成功した。今後は、FISH法と免疫染色法のシグナルが近接しているときのみ、蛍光を発するような技術を開発する。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ES細胞を用いて、チラミド増感法によるOct3/4の検出と、FISH法による特定ゲノム領域の検出を同時に行うことに成功した。ハイブリと抗原賦活化の条件域がかなり狭いが、再現性よく同時検出が可能な条件を見出した。またOct3/4以外の転写因子や修飾ヒストンについても同様に同時検出が可能であった。

Strategy for Future Research Activity

核内タンパク質の局在と近接したFISHシグナルをProximity ligation assayによって検出する。in vitroでの培養細胞の他、組織切片における検出を目指す。

Causes of Carryover

全体計画の中で平成27年度の計画は極めて順調に遂行することができ、想定外に予算を抑制することが可能であった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

平成28年度の計画では実験の難易度が高まり、試行錯誤を繰り返すことになると予想している。前年度の予算を加えて、効率よく研究を遂行する予定である。