核内のゲノムDNAとタンパクの相互作用をin situで可視化する技術の開発

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K14529
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 目野 主税 九州大学, 医学研究院, 教授 (20311764)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 転写因子 / ゲノム / PLA法

Outline of Annual Research Achievements

本研究では特定ゲノム領域における特定転写因子の結合を in situ で検出する方法論の開発を目的としている。その原理は、(1) 特定のゲノム領域を in situ hybridization 法でラベルし、(2) ゲノムに結合した転写因子をその抗体によってラベルし、(3) 両者の近接を in situ PLA（Proximity Ligation Assay）法によって検出するものである。本法を実現させるための課題は in situ hybridization のためのホルムアミドを用いた熱変性によって、目的の転写因子の抗原性が失活してしまうことであったが、前年度までにチラミド増感法を用いることにより、転写因子の局在検出と in situ hybridization 法が両立可能なプロトコールを開発した。本年度は両者の近接性を in situ PLA で検出することを試みたが成功には至らなかった。まず、(1) や (2) のラベリングについて、digoxigenin (DIG)、dinitrophenyl (DNP) や biotin などの組み合わせを検討したが、いずれも PLA は成立しなかった。また in situ hybridization のハイブリ温度やホルムアミド濃度、さらには proteinase K による賦活化などの条件検討を行ったが、PLA の検出には至らなかった。今回の試行ではマウス ES 細胞における Nanog 転写因子とOct3/4 遺伝子付近のエンハンサーの結合性をモデルケースとしていたが、Nanog の挙動は細胞ごとに heterogeneity があることが知られているため、両者の近接性を検出できなかった可能性が考えられる。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

昨年度までにin situ hybridizationと免疫染色が両立可能なプロトコールを開発していたが、使用した細胞株と転写因子がモデルケースとして不適格であったためかPLAが成立する条件を見出すことができなかった。

Strategy for Future Research Activity

ES細胞以外の細胞株、転写因子、エンハンサーの組み合わせを試みることにより、PLA が成立できるようなモデルケースを探索する。

Causes of Carryover

PLA法を適用するまでの方法論の開発は成功したため比較的容易にPLA法を適用出来ると考えていたが、モデルとして使用した実験材料セットではPLAが成立しなかった。条件検討が困難であることも念頭に予算を節約し、翌年度まで研究を継続することにしたため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

本研究の提案実験原理に沿って様々な実験条件の検討を行うと共に、得られた結果から実験原理そのものの修正も検討する。