2015 Fiscal Year Research-status Report
物理学的・生理学的実験手法を融合した植物個体の力学刺激応答メカニズムの解明
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15K14544
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
長谷 あきら 京都大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (40183082)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
細川 陽一郎 奈良先端科学技術大学院大学, 物質創成科学研究科, 准教授 (20448088)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 細胞応答 / 力学シミュレーション / 原形質流動 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
植物が外力に応答することは古くより知られるが、定義された力を加えた細胞を直接観察することは困難であった。本研究では、我々が開発した細胞圧迫装置を用いて、生理学的手法に物理学的手法を組み合わせることで、植物細胞が継続的に与えられた中程度の外力に応答する原理の解明をめざす。
１）細胞圧迫実験系の確立：我々は、簡単な細胞圧迫装置を開発し、表皮細胞の表面が平らになるまで細胞を圧迫すると細胞質タンパク質の流動性が著しく低下することを見出した。本研究では、この装置にマイクロ圧力センサーを組み合わせて圧力を読み取る計画であったが、現状の装置では装置自体にたわみが生じるため、安定した圧力の読み取りが困難であることが分かった。そこで方針を転換し、細胞の一点に力をかけ、そこで生じた変形から力を推定することとし、この実現に向け、マイクロビーズを張り付けたガラス基板による細胞圧迫法の開発を進めた。
２）細胞圧迫応答の植物生理学的解析：我々が見出した細胞質タンパク質の流動性低下について、FRAP解析によって見かけの拡散速度（原形質流動を含む）を測定したところ、圧迫により流動速度が数分の１に低下することが確認された。また、当初の計画には無かったが、研究対象とするタンパク質を光受容体であるフィトクロムに広げ、その流動性と光吸収型の関係について解析を開始した。Yellow Chameleonを指示タンパク質として利用したカルシウム応答についても観察を行ったが、力学的刺激に対するカルシウム応答は検出できなかった。
３）計算機シミュレーションを利用した外力応答の解析：まず、圧迫による細胞の変形に注目し、それが圧迫に応じてどのように変形するかを、共焦点顕微鏡によるZ-軸スキャンを詳細に行い、多数の細胞について圧迫前後の形状を計測した。今後は、このデータをもとにモデル化の手法を検討する計画である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
まず細胞圧迫実験系については、我々が開発したような簡易装置では、どうしても10 μmオーダーの歪がおこり、この装置を通じて定義した力をかけることは非常に困難であることが判明した。また、圧迫装置自体を作り直してこの問題を解決するには、本予算では困難であった。そこで、方針を転換し、細胞に局所的に力を加え、変形の様子を詳しく測定するとともに、シミュレーションによる解析も組み合わせ、力を間接的に推定する方法に切り替えることとした。FRAP解析については、既存の技術を利用することにより測定に成功した。今後は、様々な条件（部分圧迫を含む）でFRAP法による流動性解析を進める予定である。計算機シミュレーションのついては、細胞変形が共焦点顕微鏡で詳細に観察できることが確認され、実際、我々の装置によって細胞列によって異なるパターンの変形が生じていることが明らかにされた。今後は、さらなるデータ収集に努めるとともに、この結果を理解するための計算機シミュレーションを行う計画である。
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| Strategy for Future Research Activity |
１）細胞圧迫実験系の確立
上に述べたように、当初の予定の応力直接計測は困難であることが判明したため、今後は部分圧迫とそれによる細胞変形の解析を関係付けることで、細胞にかかる力を評価する計画である。この手法が確立できれば、装置自体は単純のものであるので、レーザーによる蛍光観察にもとづく顕微鏡（共焦点レーザー顕微鏡を含む）に広く応用できると期待される。
２）細胞圧迫応答の植物生理学的解析
動物細胞などに関する報告から植物の圧迫応答でもカルシウムイオンが関わることが想定されたが、結果は否定的であった。そこで今後は、我々が得意とする光受容体タンパク質を実験対象に加え、光による受容体の性質変化と流動性の関わりや、その生理学的な意義について研究を進める計画である。
３）
上に述べたように、圧力計を用いた装置を本予算内で実現することは困難であることが判明し、当初の単純なモデルに基づくシミュレーションを、計画通りに進めることはできなかった。しかしながら、既に述べたように、部分的に力を加えた場合の変形状態を詳細に観察するための手法は整いつつあるので、今後は、この結果を利用したシミュレーションを進める計画である。
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| Causes of Carryover |
研究の進捗に伴い、当初の計画通りにシミュレーション計画を行うことが困難であることが分かった。そこで計画を練り直した結果、初年度に行う予定であったシミュレーション計算の一部を次年度に行うこととした。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
シミュレーションに必要なデータ収集を引き続き行い、これをもとにモデル構築とそれに基づくシミュレーション計算を開始する。このためには、植物材料を用いた実験のための消耗品（16万5千円）が必要である。
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Research Products
(2 results)
