2015 Fiscal Year Research-status Report
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15K14545
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
田村 謙太郎 京都大学, 理学(系)研究科(研究院), 助教 (40378609)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | シロイヌナズナ / キネトコア / ヒストン / タンパク質複合体 / プロテオミクス / 相互作用 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
娘細胞への安定的な遺伝情報の継承は，個体の生命維持にとって必須な細胞プロセスである．染色体の正しい分配制御するキネトコアの構成タンパク質を同定することを目的とした．
本年度はまず，キネトコアに特異的に存在するヒストンタンパク質とGFPの融合タンパク質を発現する形質転換シロイヌナズナを作成した．この形質転換植物体からタンパク質を抽出し，免疫沈降を行ってその免疫沈降産物を質量分析に共した（インタラクトーム解析）．しかしながら，質量分析では数多くのタンパク質を同定することが出来なかった．これはヒストン-GFP融合タンパク質が充分量発現していなかったことに原因があると考えられた．そこで，別のキネトコア構成タンパク質とGFPとの融合タンパク質を発現するシロイヌナズナを作成した．この植物体ではGFP蛍光がキネトコア様構造に局在しており，充分量の蛍光量が確認されたことから，インタラクトーム解析に耐えうる材料になると考えている．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初計画していたキネトコアヒストン-GFP融合タンパク質を発現する形質転換体は，残念ながらインタラクトーム解析には不適であったが，別のキネトコア構成タンパク質を発現する形質転換体が既に作成できており，今後の研究の遂行には問題無いと考えている．
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度は新たに作成したキネトコア構成タンパク質を発現する形質転換体を用いたインタラクトーム解析を行う．この形質転換体からタンパク質を抽出し免疫沈降を行う．免疫沈降を質量分析に共し，キネトコアタンパク質と相互作用するタンパク質群の同定を行う．このインタラクトーム解析に加えて，シロイヌナズナ標準化cDNAライブラリーを用いた酵母ツーハイブリッド法による相互作用タンパク質の探索を同時に行う．
同定された候補因子に関しては蛍光タンパク質を利用した局在解析を行い，キネトコアでの局在を確認する．キネトコアでの局在が確認された因子に関しては，T-DNAノックアウト変異体の単離及び人工microRNAによるノックダウン株の作出を行って，これら変異体の表現型を観察する．最終的に，キネトコアタンパク質の細胞内および植物個体発生における新規な役割を明らかにしたい．
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| Causes of Carryover |
当初計画にしていた形質転換体での解析が困難であることが分かったため，最適な形質転換体の新たな作成および条件検討に時間がかかったため．
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
引き続き，植物特異的なキネトコア構成タンパク質群の探索とその解析に必要な経費として使用する．
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[Journal Article] Phosphorylation of C-terminus of RHD3 has a critical role in homotypic ER membrane fusion in Arabidopsis2016
Author(s)
H. Ueda, E. Yokota, K. Kuwata, N. Kutsuna, S. Mano, T. Shimada, K. Tamura, G. Stefano, Y. Fukao, F. Brandizzi, T. Shimmen, M. Nishimura, and I. Hara-Nishimura
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Journal Title
Plant Physiology
Volume: 170
Pages: 867-880
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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