2016 Fiscal Year Annual Research Report
RNA-interacting FRET assay that allows realtime detection of RNA-protein interaction
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15K14554
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| Research Institution | Kyoto Prefectural University |
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Principal Investigator |
小保方 潤一 京都府立大学, 生命環境科学研究科, 教授 (50185667)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | RNA・タンパク質相互作用 / 蛍光共鳴エネルギー移動 / FRET / RNA-interacting FRET / psbE / CREF3 / iSpinach |
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| Outline of Annual Research Achievements |
タンパク質分子間の近接相互作用をリアルタイムで検出する手法の一つにFRET(蛍光共鳴エネルギー移動)法がある。本研究ではこの手法を拡張し、特定のRNA分子とタンパク質分子間の相互作用を蛍光変化によって検出する拡張型FRET法の開発を試みた。筆者はこの方法をRNA相互作用型FRET法（RNA-interacting FRET=RiFRET法）と名付けたが、その要諦は、蛍光発色団と特異的に結合する性質をもったアプタマー配列を調べたいRNA分子に導入して蛍光標識RNAを作成し、そのRNAと蛍光標識タンパク質との相互作用を蛍光スペクトルの経時変化によって検出・解析するということである。実際には、当初の研究計画に従い、葉緑体RNA編集反応に関わるpsbE-ｍRNA とCREF3タンパク質の相互作用系をモデルに実験を進めたが、当初予期していなかった二つの困難に直面した。一つは、CREF3がおそらくその固有の性質のために大腸菌でのクローニングできなかったことである。そこで、完全な無細胞系を用いて、黄色蛍光タンパク質(Venus)とCREF3との融合タンパク質(Venus-CREF3)を作成した。次に、緑色蛍光標識配列（iSpinach配列）を導入したpsbE RNAをin vitroで調製し、両者を混合してpsbE-iSpinachからVenus-CREF3への蛍光エネルギー移動を検討した。その結果、実際に反応セル中で蛍光スペクトルの経時変化が観察されたが、RNA分子からの蛍光の経時減衰が予想以上に大きく、分子間エネルギー移動を明確に結論づけるには至らなかった。以上の実験から、RiFRET反応を実証するため必要な実験系の条件が明確になってきた為、現在、psbEとCREF3に代わる特異的なRNAとタンパク質の組み合わせについて、同様な実験系の作成を進めている。
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| Remarks |
上記の研究室ホームページに今後掲載する予定。
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Research Products
(1 results)
