2016 Fiscal Year Research-status Report
ゲノム編集技術と核移植を併用した短期間での遺伝子改変クローン集団の作出
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15K14562
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
高宗 和史 熊本大学, 大学院先端科学研究部(理), 教授 (20206882)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
北野 健 熊本大学, 大学院先端科学研究部(理), 准教授 (40336219)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | ゲノム編集 / 核移植 / 両生類 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1.人工ヌクレアーゼを用いたゲノム編集は、遺伝子機能解析に有効な技術である。しかし、目的の変異が入った個体を選別し、遺伝子機能解析のために必要な数の変異個体集団を確保するためには、F1世代やF2世代を得る必要がある。無尾両生類アフリカツメガエルの場合、性成熟期間が長いため、同一変異個体集団を確保するためには時間を要する。この問題を解決するために、核移植により同一変異個体集団を短時間で確保することが本研究の目的である。核移植によるクローン個体作成の成功率は一般に低いことから、いかに簡便かつ短時間で操作ができ、多くの核移植個体を作成できるかが重要なポイントになる。これまで卵子の雌性核を除去する方法として微小ピペットによる物理的な除去法を開発してきたが、この方法の場合、鍛錬した技術と時間を要するという欠点があった。そこで、紫外線照射により一度に数多くの卵子の雌性核を不活化する条件を見出した。この卵子に核を移植することで正常個体を得ることができたことから、紫外線照射による発生への影響がないことを確かめた。CRISPR RNAでチロシナーゼ遺伝子に変異を入れた胚細胞を用いて核移植を行い、同一変異が入ったクローン集団を作成することに成功した。
2.目的の遺伝子に変異が入った個体の細胞を用いて核移植を行うことでクローン個体集団を恒常的に確保するために、胚細胞の凍結保存法を検討している。アフリカツメガエルの初期胚細胞を凍結保存し、解凍後にその生存性を保持する技術は未だ確立していない。
3.チロシナーゼ遺伝子に変異を入れるためのCRISPR RNAの作成に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
1.卵子の雌性核を紫外線照射により不活性化する条件を明らかにした。この卵子に核移植を行い、正常発生を行う胚を得ることができた。正常発生する個体の率が低いという問題は残っているものの、短時間で多くの卵子に対して核移植を行うことが可能になったことで、解析に必要な個体数を確保することが可能になった。
2.遺伝子解析のための時間は、一週間培養した胚細胞の核移植が成功したことにより確保できたが、目的の変異が入った個体の細胞を用いた恒常的な核移植のためには、やはり凍結保存法の確立が必要である。未だ、凍結した初期胚細胞の核を用いた核移植は成功していない。
3.チロシナーゼ遺伝子に変異を効果的に入れるCRISPR RNAを作成することに成功した。このRNAを用いてチロシナーゼ遺伝子に変異を入れ、この細胞の核を移植することにより、同一遺伝子変異を有する原腸胚集団を得ることができた。しかし、その後の正常発生率が低かったため、チロシナーゼ遺伝子変異における表現型への影響については確認できていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
チロシナーゼ遺伝子の一部が欠失するように2種類のCRISPR RNAを作成し、これらRNAを受精卵に顕微注入する。原腸胚になったところで細胞を解離し、解離細胞の一部からゲノムDNAを抽出する。ゲノミックPCRにより一部が欠失したチロシナーゼ遺伝子を含む個体を選別し、その個体の細胞核を用いて紫外線により雌性核を不活性化した卵子に核移植する。この個体が原腸胚になったところで胚の一部より抽出したDNAを鋳型にPCRを行い、チロシナーゼ遺伝子に明らかな変異が入った個体を選別し、残りの細胞を用いて核移植を行う。この核移植した集団より10個体ほど取り出し、それぞれの個体のチロシナーゼ遺伝子に同じ変異が入っていることを確認する。残りの個体をオタマジャクシまで飼育し、全ての個体においてチロシナーゼ遺伝子不活性化により色素合成が起こらないことを明らかにすることで、核移植によるクローン個体作成でゲノム編集個体解析を短期間で行えることを証明する。また、ゲノム編集個体の細胞を凍結し、解凍した後に核を取り出して核移植を行うことで核移植個体を作成する条件を確立する。この際、細胞を生きたまま凍結することにこだわらず、供与核の凍結保存法という観点から条件を検討する。これら結果をまとめて、核移植によるゲノム編集個体解析の有用性について公表する。
次に、Xtr遺伝子に変異を入れるTALEN mRNAを用いて、同様にゲノム編集個体を作成する。これまで、Xtrタンパク質の発現解析から、Xtr遺伝子のzygoticな発現は始原生殖細胞が生殖巣原基に入り込んだ後に起こることが予想されている。そこで、Xtr遺伝子機能を欠失させたゲノム編集個体を用いてこれまでの観察結果を証明し、これまでの結果をまとめて公表する。
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Research Products
(1 results)
