稔性回復遺伝子ホモログの人工進化による特異的RNA結合タンパク質の合成

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K14626
• Research Institution: Nara Institute of Science and Technology
• Principal Investigator: 藤井 壮太 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 助教 (90716713)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 稔性回復遺伝子 / 人工進化 / RNA編集

Outline of Annual Research Achievements

任意のRNAに結合するタンパク質を生み出す事ができるだろうか？本研究では，本研究ではRf-PPRと呼ばれるRNA結合タンパク質をコードする多重遺伝子群に人為的に変異を導入することで，任意のRNAに結合するタンパク質を人工進化させる事を目指す．
今年度はエラー誘発PCRによってRf－PPRに人為的に変異を導入する実験系の構築を試みた．まず、Rf－PPRのパラログをdegenerate PCRを用いて4種のアブラナ科植物から増幅した．これらの中には推定40種類のRf－PPRパラログ配列が存在すると考えられる．現在これらの断片を鋳型に混合PCRを行い、試験管内でのPCRエラーによって多様なRf-PPRライブラリーが構築できるか検査している．一方、Random priming法によってRf-PPR間の相同性組換えを促しRNA認識特異性の多様性が拡大されたライブラリーの構築を試みたが、現在までに良好なPCR増幅断片は得られていない．
また、特異的なRNAへの結合能力を獲得した人工進化PPRの選抜を目指し、蛍光タンパク質Venusを用いたスクリーニング系の開発を行った．タンパク質翻訳の開始点となるShine-Dalgarno(SD)配列部分がRNA二次構造を取るような配列をデザインし、PPRがその部分に結合した場合SD配列がオープンになり、Venusが翻訳されるというシステムである．モデルPPRタンパク質であるPPR10の結合配列をSD配列と連結して二次構造を取るようにデザイン(PPR10-SD隠蔽型ベクター)したところ、実際下流に連結したVenusの発現は見られなくなった．一方、同じ大腸菌株にPPR10を発現させたところ、蛍光が回復した．従って、PPRの結合活性を簡易にスクリーニングできる系が開発されたと考えている．

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

上述したとおり新規レポーター系の開発は概ね完了できたと考えている．
その一方で、多様性のあるRf－PPRライブラリーの開発は現在までに成功しておらず、最大の理由はRandom priming法によるPCRフラグメント間の組換え促進系が確立できなかったことにある．この遅れによって任意のRNA配列への結合活性を持つPPRのスクリーニング実験まで到達することができなかった．
本研究の関連で、Rf－PPRの一種であるRFL2の詳細な機能解析を行ってきた．この解析より、Rf－PPRがRNAの二次構造のリモデリングに関わる可能性が示唆され、研究開始当初は未解明であったPPRの機能を見出すことができた．

Strategy for Future Research Activity

今年度は、引き続きエラー誘発PCRによって多様性のあるRf－PPRライブラリーの開発を目指す．これまでにPCRで増幅した推定40種類のRf－PPR断片を鋳型としてPCRを行い、相同性組換えを誘発する．これらをクローニングし、配列をシークエンスすることで、Rf－PPRライブラリーの多様性を評価する．
ライブラリーを得られた場合、PPR10-SD隠蔽型ベクターを発現する株に導入し、Venusの蛍光が回復するコロニーをスクリーニングする．コロニーからプラスミドを単離し、中身のRf－PPR配列を確認する．このRf－PPRがPPR10結合配列に対して結合活性を持つかどうかを、in vitroのRNA結合アッセイによって評価する．

Causes of Carryover

昨年度は人工進化させたRf－PPRをシークエンス解析によってスクリーニングする予定であったが、Random priming法を用いた良好な組換えDNA断片が得られず、スクリーニングまで至らなかったため．

Expenditure Plan for Carryover Budget

今年度はこれらの次年度使用額の多くをRf－PPRのシークエンス解析を行うための消耗品費に割り当てる予定である．

Research Products

• [Journal Article] Calcium signalling mediates self-incompatibility response in the Brassicaceae (2015)
  • Author(s): Megumi Iwano, Kanae Ito, Sota Fujii, Mitsuru Kakita, Hiroko Asano-Shimosato, Motoko Igarashi, Pulla Kaothien-Nakayama, Tetsuyuki Entani, Asaka Kanatani, Masashi Takehisa, Masaki Tanaka, Kunihiko Komatsu, Hiroshi Shiba, Takeharu Nagai, Atsushi Miyawaki, Akira Isogai & Seiji Takayama
  • Journal Title: Nature Plants Volume: 1 Pages: 15128
  • DOI: http://dx.doi.org/10.1038/nplants.2015.128
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research