Synthesis of a specific RNA-binding protein via the artificial evolution of Rf-PPR homologs

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15K14626
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 藤井 壮太 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 助教 (90716713)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 稔性回復遺伝子 / 人工進化 / RNA編集

Outline of Annual Research Achievements

任意のRNAに結合するタンパク質を生み出す事ができるだろうか？近年，ゲノム編集技術が急速に発展している中で，標的RNAの発現を制御する技術の確立への期待は大きい．その一方で，生体内におけるRNAが受ける転写後修飾を自在にコントロールできる程柔軟な実験系は存在しない．本研究では遺伝育種学によって見出された，細胞質雄性不稔性(Cytoplasmic male sterility: CMS)における稔性回復遺伝子(Fertility restorer: Rf)が持つ性質に着目し，この課題の克服を目指す．RfはCMS原因タンパク質の発現を抑制する事が知られており，PPRと呼ばれるRNA結合タンパク質をコードする．本研究ではRf-PPRに人為的に変異を導入することで，任意のRNAに結合するタンパク質を人工進化させる事を目指した．
これまでの研究で、エラー誘発PCRによってRf-PPRに人為的に変異を導入する実験系の確立を目指した．Random Priming法を用いて相同性組み換えを誘発し、RNA認識特異性が拡大されたPPRライブラリーの構築を試みたが、良好なPCR断片を得ることは難しかった．一方、アブラナ科植物のゲノムDNAから多様なRf-PPRフラグメントを次世代シークエンサーによって一度に大量に同定することを試みた．しかし、配列のヘテロ性が少ないためかシークエンス解析がうまくいかず、良好なデータは得られなかった．
一方、個々のRf-PPRタンパク質の機能解析が進展し、RFL2タンパク質がミトコンドリアのorf291遺伝子のRNAを切断する機能を持つことを明らかにした．