2015 Fiscal Year Research-status Report
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15K14627
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| Research Institution | Ishikawa Prefectural University |
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Principal Investigator |
濱田 達朗 石川県立大学, 生物資源環境学部, 准教授 (50310496)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | イネ / アスパラギン酸プロテアーゼ / 根圏 / タンパク質 / 窒素源 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
イネ由来アスパラギン酸プロテアーゼ(ASP)遺伝子OsASP2を導入した形質転換イネにおいて、組換えOsASP2タンパク質が根圏中に分泌されているかを確認するために、抗OsASP2抗体によるウェスタンブロッティングを行う必要がある。そこで、OsASP2を大腸菌で発現させ、その組換えOsASP2を抗原として抗OsASP2抗体を作製した。
3種類のイネ由来ASP遺伝子（OsASP1a、OsASP1bおよびOsASP2)およびウツボカズラ由来ASP遺伝子であるネペンテシンI遺伝子（NaNEP1）がそれぞれ発現している形質転換イネにおいて、導入したASP遺伝子産物による根圏でのプロテアーゼ活性を見るために、カゼイン培地による検定をおこなったところ、タンパク質分解が見られなかった。根圏でのカゼイン分解が見られなかった原因として、遺伝子導入時に用いたCaMV 35SプローモーターではASP遺伝子の発現が不十分であった可能性が考えられる。そこで、イネにおいて強力な発現プロモーターとして知られているユビキチンプロモーターやアクチンプロモーターの下流にシロイヌナズナ由来ASP遺伝子（AtASP1)またはOsASP2遺伝子を連結したコンストラクトを導入した形質転換イネを、現在、作製中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
当初の予定では、OsASP1a、OsASP1b、OsASP2およびNaNEP1遺伝子を発現させたイネにおいて、導入した遺伝子産物由来のASPが根から分泌され、根圏中に存在するタンパク質を分解することが期待されていた。しかし、カゼイン培地による検定の結果、根からのASPの分泌が不十分であることが考えられ、新規にASP遺伝子を過剰発現させた形質転換イネを作製する必要がでてきた。そのため、当初、計画していたASP過剰発現イネの培養液におけるASPタンパク質のウェスタンブロッティング、およびASP活性測定を中止した。
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| Strategy for Future Research Activity |
イネが根圏中のタンパク質を窒素源として利用するためには、根からの十分なASPの分泌、およびそのASPによるタンパク質分解が必要である。このような表現型を示すイネを作製するために、CaMV 35Sプローモーターよりも強力な発現プロモーターであるユビキチンプロモーターやアクチンプロモーターを用いることにした。また、発現させるASP遺伝子として、シロイヌナズナでの実績があるAtASP1遺伝子を、また、AtASP1遺伝子がイネで機能しない場合に備えて、イネ由来のOsASP2遺伝子の2種類を選択した。今後、新規作製した形質転換イネにおいて、遺伝子発現解析およびカゼイン培地検定をおこない、根圏中のタンパク質分解能の高いイネを選抜する。このようにして選抜したイネを用いて、当初の計画であるイネ培養液におけるASPタンパク質のウェスタンブロッティング、ASP活性測定および生育検定実験をおこなう。
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| Causes of Carryover |
平成27年度の実験計画が変更となり、実験器具類・消耗品の購入および実験補助の人件費が当初、予定していた金額を下回ったため、次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
形質転換イネの作製および栽培をおこなうための培地や抗生物質、プラスチックシャーレ、ワグネルポット、栽培用照明のハロゲンランプや照明灯などの消耗品類を購入する。形質転換イネの解析のための消耗品として、RNA抽出キットや定量的RT-PCR試薬、分泌プロテアーゼの解析のための遠心式限外膜ろ過ユニットやプロテアーゼ活性測定キット、その他の試薬等を購入する。イネ形質転換体の栽培や実験のサポートとして実験補助の人件費を計上する。また、形質転換イネの解析に使用するための人工気象器が故障しおり、解析に支障がでるため、平成28年度予算で人工気象器の修理を行う。
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