2015 Fiscal Year Research-status Report
組換え実験で葉緑体に生じたミニサークルの複製機構の解明とベクターの開発
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15K14629
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| Research Institution | Kyoto Sangyo University |
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Principal Investigator |
寺地 徹 京都産業大学, 総合生命科学部, 教授 (90202192)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
木村 成介 京都産業大学, 総合生命科学部, 准教授 (40339122)
山岸 博 京都産業大学, 総合生命科学部, 教授 (10210345)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 葉緑体ゲノム / 斑入り / DNA複製 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、葉緑体の遺伝子組換え実験の過程で偶然得られた、斑入りのタバコを材料に用いて、葉緑体DNAの複製、組換え、斑入りの新しい機構などを解明することを目的とする。これまでの研究で、この組換えタバコでは、葉緑体ゲノムが大きな（>150kb）環状DNA（ラージサークル）と小さな（20kb）環状DNA（ミニサークル）に二分割されていること、ミニサークルのコピー数が著しく増大し、その状態が何世代にもわたって安定に保持されていること、生育温度によりラージサークルとミニサークルの比が変化し、低温でミニサークルの割合が高まることなどがわかっている。
今年度は、ミニサークル上にあると予想される、葉緑体DNAの複製に必要な領域を絞り込むため、ミニサークルDNAをさらに小さな断片に分割して大腸菌のプラスミドベクターへクローニングし、これに抗生物質（スペクチノマイシン）耐性遺伝子であるaadAの発現ユニットを付加した後、再度、パーティクルボンバードメント法により野生型タバコの葉緑体へ導入する実験を行った。
具体的には、ミニサークルDNAをHindIIIで消化して、３つの断片（miniC_1: 11.3kb、miniC_2: 6.4kb、miniC_3: 4.2kb）に分割し、それぞれをpBluescriptII SK+にクローニングした。その結果、miniC_1およびminiC_3を持つプラスミドを得ることができた。miniC_2についてはクローニングできなかったが、さらにこれを２つの断片（miniC_2A: 4.1kb、miniC_2B: 2.3kb）に分割してクローニングし、miniC_2Bを持つプラスミドを得ることができた。なお、miniC_3については実験をさらに進め、aadA発現カセットを付加したコンストラクトを12ショット、パーティクルガンでタバコの葉へ撃ち込んだ。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ミニサークルDNAを分割し、それをもとに葉緑体形質転換用のプラスミドコンストラクトを構築することができた。またその一部について、再度、タバコの葉緑体へ導入するための準備が整いつつあるので、研究は概ね計画通り、順調に進んでいると判断している。一方、ミニサークルDNAに由来する、miniC_2Aと名付けた 4.1kbのDNA断片が、大腸菌のプラスミドへクローニングできないという、予期せぬ結果が得られている。この領域が葉緑体の複製起点を持つかどうかはわからないが、DNAをさらに分割する、領域を少しずらすなどの工夫をして、この領域を含むDNA断片も葉緑体形質転換用のプラスミドコンストラクト化する必要がある。
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| Strategy for Future Research Activity |
上記のように、miniC_2Aを含む領域も含め、ミニサークルDNAが持つすべての領域を葉緑体形質転換用のプラスミドコンストラクト化して、実際にタバコの葉緑体へ導入することに注力する。
一方、この斑入りの組換え体で認められた、葉緑体ゲノムが二分割されて保持されるという現象を再現できるか、rps16ターミネーター配列をタバコの葉緑体ゲノムの逆位反復配列に導入する実験をはじめる。
さらに、斑入りの原因を探るため、Blue Native PAGEやウェスタンブロットなどの手法を用いて斑入りの組換え体の葉緑体タンパク質を分析し、野生型タバコのものと比較して、どの遺伝子産物がどのように違うかを明らかにしたい。
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| Causes of Carryover |
学会発表などに必要な旅費を他の研究経費で工面することができたから。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度は、植物の培養や栽培管理など、手間のかかる実験が多くなると予想されるので、アルバイトの人件費として使用する。
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