2017 Fiscal Year Annual Research Report
Studies on the replication mechanism of a mini circle found in transplastomic plants and a vector development
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15K14629
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| Research Institution | Kyoto Sangyo University |
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Principal Investigator |
寺地 徹 京都産業大学, 総合生命科学部, 教授 (90202192)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
木村 成介 京都産業大学, 総合生命科学部, 教授 (40339122)
山岸 博 京都産業大学, 総合生命科学部, 教授 (10210345)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 葉緑体 / 遺伝子組換え / 斑入り / DNA複製 / apx / タバコ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、葉緑体の形質転換実験で偶然得られた「斑入りのタバコ」の葉緑体ゲノムの解析を基にする。この実験では、大きさ約20kbの環状DNA分子（以後、ミニサークルと呼ぶ）が発見されており、本研究は、この分子の解析を通じて、葉緑体DNAの複製や組換えの機構を明らかにすることを目的とした。以前の研究で、ミニサークルは、組換え型の葉緑体DNAからのループアウトにより生じたこと、コピー数が残りの葉緑体DNAと比べ10倍以上に増大していること、自殖種子を経て何世代も安定に保持されることなどがわかっている。 本研究では、ミニサークル上にあると予想される葉緑体DNAの複製起点を絞り込むため、このDNAをさらに分割して大腸菌のプラスミドベクターへクローニングし、これに抗生物質耐性遺伝子であるaadAを付加した後、パーティクルガンにより、再度タバコの葉緑体へ導入する実験を行った。
具体的には、ミニサークルをHindIII消化により、#1(11.3kb)、#2(6.4kb)、#3(4.2kb)の3つに分割し、そのうち#1と#3はベクターのHindIIIサイトへ導入できた。また#2は、さらに#2A(4.1kb)と#2B(2.3kb)の2つに分割し、うち2AのみをIn-Fusion法でベクターへ導入できた。これら3種のプラスミドにそれぞれaadAを連結して、タバコの葉に撃ち込んだところ、いずれのコンストラクトからも形質転換体が得られた。最も多くの形質転換体が得られた#2Aから、インバースPCRで欠失変異体を作り、3.2kb、2.2kb、1.2kbの大きさの葉緑体DNA断片をもつ3種類のプラスミドを作成した。これらをパーティクルガンでタバコの葉に60回、それぞれ撃ち込んだところ、合計で10個のカルスもしくはシュートが得られ、最小1.2kbの葉緑体DNA断片でも葉緑体で複製可能であることが示唆された。
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