2015 Fiscal Year Research-status Report
低温で卵態休眠が誘起されるスミスアケハダニにおける休眠遺伝子の特定
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15K14668
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| Research Institution | Ibaraki University |
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Principal Investigator |
後藤 哲雄 茨城大学, 農学部, 教授 (60178449)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 応用動物 / 遺伝子 / ゲノム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
スミスアケハダニの休眠遺伝子の候補を得るため、低温飼育（15℃）により得られた休眠卵産下雌および高温飼育（25℃）により得られた非休眠卵産下雌をそれぞれ200個体プールしてメッセンジャーRNAを抽出し、次世代シーケンサーを用いたRNA-Seqによって網羅的に発現量を解析した。RNA-SeqのデータはMA-Plot法により処理し、有意に発現量に差がある遺伝子を195遺伝子(うち85遺伝子が休眠卵産下雌で高発現、110遺伝子が非休眠産下雌で高発現)を得ることに成功した（FDR<0.01）。
これらの候補遺伝子の機能解析のため、ハダニ類における経口RNAi法の確立を試みた。第一に、糖を含んだ人工飼料にdsRNAを溶解して、パラフィルムで挟んで与えることによって、ハダニに吸汁させることに成功した。そこで、細胞の生存に必須なV-ATPaseのdsRNAを与えたところ、投与個体の多くで消化管の細胞が壊れ、死亡することを確認した。これらの成果により、ハダニ類の経口RNAi法の基盤は確立したと考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
休眠個体と非休眠個体に特異的に発現する遺伝子数を特定できていること、RNAi実施に必要なハダニへの施用法が完成していることから、当初予定通り順調に進行している。
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| Strategy for Future Research Activity |
第一に、RNA-Seqにより得られた候補遺伝子から、休眠に関わる可能性がより高い遺伝子の絞込みを行う。前段階として、相対定量による遺伝子発現の定量を可能にするために、適切なリファレンス遺伝子を定める。すなわち、actinやtublinといった、節足動物一般で広く使われるリファレンス遺伝子を候補として、スミスアケハダニにおいて生理状態や日齢に関わらず、安定して発現する遺伝子を特定する。その上で、定量PCR法によって休眠卵産下雌と非休眠卵産下雌の間で、候補遺伝子の発現量の差を明らかにし、より明瞭に差が確認された遺伝子を休眠遺伝子候補として絞り込む。
第二に、RNAi法を用いた候補遺伝子の機能解析を行う。まず、経口RNAi法による遺伝子発現抑制の効果を遺伝子ごとに確かめる。すなわち、休眠遺伝子候補についてdsRNAを合成し、経口投与した後、経時的な遺伝子発現の変化を定量PCR法によって明らかにする。経口RNAiの場合、候補遺伝子のdsRNAが消化管内から他の部位まで移動する必要があるが、もし移動が何らかのメカニズムによって妨げられている場合、消化管の細胞を壊しうることを先に確認したV-ATPaseのdsRNAと共に候補遺伝子のdsRNAを与えることで、移動を試みる。これらの方法により遺伝子発現の抑制が確立したら、処理雌の卵の休眠率を測定し、卵の休眠への影響を明らかにすることで休眠遺伝子を特定する。
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| Causes of Carryover |
薬品等の購入時に端数が生じたため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
消耗品の購入時に合算して使用する。
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Research Products
(2 results)
