2016 Fiscal Year Annual Research Report
Transmission mechanims of Tomato yellow leaf curl virus
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15K14670
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
宇垣 正志 東京大学, 大学院新領域創成科学研究科, 教授 (20323438)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | ジェミニウイルス / タバココナジラミ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
全長0.8 mmと微小なタバココナジラミ(Mediterranean)を約1,000頭解剖して中腸組織をインタクトに取り出し、そこから全RNAを1.2 ug得た。SMART法により完全長cDNAを合成してPCR (6サイクル)で増幅し、PCR産物を電気泳動した後、1 kbp以下、1-2 kbp、2-4 kbp、4-6 kbp、6 kbp以上の5段階に分画した。分画したcDNAを再度PCR (25サイクル)で増幅したところ、0.2-6 kbpまでのcDNAが偏り無く増幅された。増幅したcDNAをyeast two hybrid法のprey側ベクターに導入しライブラリーを作成した。bait側ベクターにトマト黄化葉巻ウイルスの外被タンパク質(CP)遺伝子を導入し、これ単独で転写活性化能が無いことを確認した。あらかじめbaitベクターを形質転換した酵母AH109株にpreyのコナジラミ中腸cDNAライブラリーを形質転換し、3-AT濃度を0 mM, 1 mM, 3 mM, 10 mMに振り分けた選択培地にストリークしたところ、それぞれ1.35 x 10E5、1.0 x 10E5、1.0 x 10E5、1.0 x 10E5の独立クローンから212個、1個、0個、0個の陽性コロニーが得られた。陽性コロニーを培地に塗布してシングルコロニーを単離し、コロニーからprey側ベクターを抽出してシークエンスにより塩基配列を特定した結果、4種類の受容体候補遺伝子が得られた。各候補遺伝子について、前年度に確立したRNAi法によりノックダウンすべく、in vitroで合成したヘアピンRNAを人口篩菅液とともにコナジラミに摂食させることで中腸円筒細胞に導入した。現在、ウイルスの中腸円筒細胞への取り込みに及ぼす影響について解析中である。
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