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2015 Fiscal Year Research-status Report

RNAポリメラーゼのアセチル化を介した新規転写誘導機構の解明

Research Project

Project/Area Number 15K14685
Research InstitutionThe University of Tokyo

Principal Investigator

古園 さおり  東京大学, 生物生産工学研究センター, 准教授 (90321760)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 小倉 光雄  東海大学, 付置研究所, 教授 (80204163)
Project Period (FY) 2015-04-01 – 2017-03-31
Keywordsアセチル化 / RNAポリメラーゼ / ECFシグマ因子 / 枯草菌 / 転写
Outline of Annual Research Achievements

枯草菌ECFシグマ因子の1つであるSigXが1×S胞子形成培地へのグルコース添加により活性化される現象が見出されている。SigXを活性化する炭素源はアセチル化を誘導する炭素源と共通していたこと、さらにアセチル化の基質となるアセチルCoAの主供給経路であるpdh変異によりSigX活性化が阻害された事実から、この現象にアセチル化が関与する可能性が考えられた。本研究では、グルコースによるSigX活性化という現象に着目し、RNAポリメラーゼ(以下RNAP)のアセチル化を介した新規転写制御機構の解明を目的とした。
本年度は、グルコース添加・非添加条件でRNAPにアセチル化を含めた性状の違いを明らかにする目的で、β’サブユニット(RpoC)にHisタグを導入した枯草菌株を構築してRNAPの精製を行った。Ni-NTAカラムを用いたRNAP精製画分をトリプシン消化しLC-MS/MS解析を行ったところ、α、β、β’、ωサブユニットにおいてアセチル化部位が検出され、グルコース添加条件でアセチル化部位数の増加が確認された。また、MSデータを元に精製画分に含まれるシグマ因子の半定量解析を行ったところ、SigAやSigBの存在量はグルコースの有無によって大きく変わらなかった一方で、SigXはグルコース添加条件でしか検出されなかったことから、グルコース添加条件ではSigXを含むホロ酵素形成が促進されていることが示唆された。さらに、このRNAP精製画分を用いてin vitro転写アッセイを行ったところ、SigA依存的な転写活性はグルコース添加・非添加条件で精製したRNAPの間で差が見られなかったのに対し、SigX依存的な転写活性はグルコース添加条件でより高いという結果が得られた。以上のことから、RNAPのアセチル化がSigXとのホロ酵素形成を促進し、SigX依存転写を誘導している可能性が示唆された。シグマ因子と相互作用するβおよびβ’サブユニットのアセチル化部位の変異体の作製を進めた。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

グルコース添加条件・非添加条件から精製したRNAPについてアセチル化を含めた性状の違いと転写特性の違いを明らかにし、RNAPのアセチル化がSigX活性化に関わることを強く示唆する結果を得た。当初の計画以上に進展していると考える。

Strategy for Future Research Activity

RNAPのアセチル化がSigXとのホロ酵素形成を促進する可能性を明らかにするために、シグマ因子と相互作用することが知られているβおよびβ’サブユニットを中心にアセチル化部位に対して変異導入を行い、グルコースによるSigX活性化に影響を与えるアセチル化部位の特定を行う。そのような変異株を取得できたら、in vitro転写実験やトランスクリプトーム解析を行い転写に与える影響を評価する。また、アセチル化に関わる因子の破壊株や過剰発現株を用いて、RNAPのアセチル化が転写に与える影響について検討する。

Causes of Carryover

作製した変異株の示した想定外の性質により、予定していた実験の実行を延長した。そのため、残金が発生した。

Expenditure Plan for Carryover Budget

変異株の作製法を変更した後、予定していた実験を行う。オリゴDNAに100000円、消耗品費(試薬)に83899円支出する予定である。

  • Research Products

    (15 results)

All 2016 2015

All Journal Article (2 results) (of which Peer Reviewed: 2 results,  Open Access: 2 results,  Acknowledgement Compliant: 2 results) Presentation (13 results) (of which Int'l Joint Research: 2 results,  Invited: 1 results)

  • [Journal Article] Altered acetylation and succinylation profiles in Corynebacterium glutamicum in response to conditions inducing glutamate overproduction.2016

    • Author(s)
      Mizuno Y., Nagano-Shoji M., Kubo S., Kawamura Y., Yoshida A., Kawasaki H., Nishiyama M., Yoshida M. and Kosono S.
    • Journal Title

      MicrobiologyOpen

      Volume: 5 Pages: 152-173

    • DOI

      10.1002/mbo3.320

    • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] Changes in the acetylome and succinylome of Bacillus subtilis in response to carbon source.2015

    • Author(s)
      Kosono S., Tamura M., Suzuki S., Kawamura Y., Yoshida A., Nishiyama M., Yoshida M.
    • Journal Title

      PLoS One

      Volume: 10 Pages: e0131169

    • DOI

      10.1371/journal.pone.0131169

    • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
  • [Presentation] Corynebacterium glutamicum由来ODH/PDH-E2サブユニットのアセチル化部位の機能解析2016

    • Author(s)
      阿部理乃、久保翔世、永野愛、川崎寿、吉田稔、西山真、古園さおり
    • Organizer
      日本農芸化学会2016年度大会
    • Place of Presentation
      札幌コンベンションセンター(北海道・札幌市)
    • Year and Date
      2016-03-27 – 2016-03-30
  • [Presentation] Corynebacterium glutamicum由来ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ (PEPC)のアセチル化制御はグルタミン酸生産に重要である。2016

    • Author(s)
      永野愛、山田鮎果、水野裕太、菊地正樹、白水美香子、梅原崇史、吉田彩子、吉田稔、西山真、古園さおり
    • Organizer
      日本農芸化学会2016年度大会
    • Place of Presentation
      札幌コンベンションセンター(北海道・札幌市)
    • Year and Date
      2016-03-27 – 2016-03-30
  • [Presentation] 枯草菌EF-Tuのアシル化修飾機構および制御機構の解析2016

    • Author(s)
      鈴木祥太、吉田稔、西山真、古園さおり
    • Organizer
      日本農芸化学会2016年度大会
    • Place of Presentation
      札幌コンベンションセンター(北海道・札幌市)
    • Year and Date
      2016-03-27 – 2016-03-30
  • [Presentation] 枯草菌ECFシグマ因子SigXのグルコース依存的な活性化に関わるRNAポリメラーゼのアセチル化2016

    • Author(s)
      米沢祐大、小倉光雄、鈴木祥太、吉田彩子、朝井計、吉田稔、西山真、古園さおり
    • Organizer
      日本農芸化学会2016年度大会
    • Place of Presentation
      札幌コンベンションセンター(北海道・札幌市)
    • Year and Date
      2016-03-27 – 2016-03-30
  • [Presentation] Protein lysine acetylation profile of a plasmid-free and pCAR1-harbouring Pseudomonas putida KT24402016

    • Author(s)
      ヴァシレヴァ デリアナ、水口千穂、古園さおり、吉田稔、岡田憲典、野尻秀昭
    • Organizer
      日本農芸化学会2016年度大会
    • Place of Presentation
      札幌コンベンションセンター(北海道・札幌市)
    • Year and Date
      2016-03-27 – 2016-03-30
  • [Presentation] 山本 寛之、吉田 彩子、富田 武郎、古園 さおり、葛山 智久、西山 真2016

    • Author(s)
      Thermus thermophilusにおいてアセチル化を受けるCoAトランスフェラーゼの機能と制御機構の解析
    • Organizer
      日本農芸化学会2016年度大会
    • Place of Presentation
      札幌コンベンションセンター(北海道・札幌市)
    • Year and Date
      2016-03-27 – 2016-03-30
  • [Presentation] Protein acylation: a post-translational modification in response to nutrient and metabolism.2016

    • Author(s)
      Saori Kosono
    • Organizer
      異分野融合ワークショップ「微生物生命システム研究と合成生物学 の融合」
    • Place of Presentation
      奈良先端科学技術大学院大学(奈良県・生駒市)
    • Year and Date
      2016-03-17 – 2016-03-18
    • Invited
  • [Presentation] Change of protein acyl modifications in response to glutamate overproduction in Corynebacterium glutamicum2015

    • Author(s)
      Saori Kosono
    • Organizer
      東京大学生物生産工学研究センター国際シンポジウム「微生物の環境への応答と適応、そして進化」
    • Place of Presentation
      東京大学(東京都・文京区)
    • Year and Date
      2015-10-21
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Corynebacterium glutamicumにおける短鎖アシル化修飾を介したホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(PEPC)の機能調節2015

    • Author(s)
      永野愛、水野裕太、西山真、古園さおり
    • Organizer
      日本農芸化学会関東支部2015年度支部大会
    • Place of Presentation
      お茶の水女子大学(東京都・文京区)
    • Year and Date
      2015-09-26
  • [Presentation] 枯草菌EF-Tuのアシル化修飾による翻訳制御機構の解析2015

    • Author(s)
      鈴木祥太、古園さおり
    • Organizer
      日本農芸化学会関東支部2015年度支部大会
    • Place of Presentation
      お茶の水女子大学(東京都・文京区)
    • Year and Date
      2015-09-26
  • [Presentation] Altered protein acetylation and succinylation profiles in Corynebacterium glutamicum in response to L-glutamate overproduction2015

    • Author(s)
      Saori Kosono, Yuta Mizuno, Megumi Nagano-Shoji, Shosei Kubo, Yumi Kawamura, Ayako Yoshida, Hisashi Kawasaki, Makoto Nishiyama, and Minoru Yoshida
    • Organizer
      第18回日本ドイツ酵素工学ワークショップ
    • Place of Presentation
      京都大学(京都府・京都市)
    • Year and Date
      2015-09-14 – 2015-09-15
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Corynebacterium glutamicumにおける短鎖アシル化修飾を介したホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(PEPC)の機能調節2015

    • Author(s)
      永野愛、水野裕太、西山真、古園さおり
    • Organizer
      2015年度グラム陽性菌ゲノム機能会議
    • Place of Presentation
      雄山荘(滋賀県・大津市)
    • Year and Date
      2015-08-27 – 2015-08-28
  • [Presentation] 枯草菌EF-Tuのアシル化修飾による翻訳制御機構の解析2015

    • Author(s)
      鈴木祥太、古園さおり
    • Organizer
      2015年度グラム陽性菌ゲノム機能会議
    • Place of Presentation
      雄山荘(滋賀県・大津市)
    • Year and Date
      2015-08-27 – 2015-08-28

URL: 

Published: 2017-01-06  

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