2015 Fiscal Year Research-status Report
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15K14698
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| Research Institution | Aoyama Gakuin University |
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Principal Investigator |
阿部 文快 青山学院大学, 理工学部, 教授 (30360746)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 深海好圧性細菌 / ペプチド輸送体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
深海性好圧性細菌Shewanella violacea DSS12株、Shewanella benthica DB6705株およびColwellia piezophila Y233GT株を対象とし、ペプチド輸送体遺伝子のクローニングを行った。DSS12株では全ゲノム配列が、DB6705株とY233GT株では同種菌株を用いた全ゲノム配列が公開されている。そこで、Shewanella oneidensisのペプチド輸送体PepTsoのアミノ酸配列をクエリーとし、BLAST検索を行った。その結果、S. violaceaに4個、S. benthicaに1個、およびC. piezophilaに2個のペプチド輸送体遺伝子が見いだされた。そこで特異的プライマーを用いてそれぞれのゲノムDNAを鋳型にPCRを行った。各ORFを6xHisタグを有するpCold Iベクターに挿入し、得られたプラスミドを大腸菌BL21株に導入した。ウエスタンブロッティングを行ったところ、IPTG誘導後数時間でペプチド輸送体の発現が確認された。超音波破砕により調製した細胞抽出物を界面活性剤ドデシルマルトシド（DDM）で処理し輸送体タンパク質の可溶化を図った。ところがいずれも15,000 rpm程度の高速遠心で沈殿し、可溶化されていないことがわかった。IPTG濃度や処理時間を調整し発現量を低くしても、この状況は改善されなかった。そこで可溶性を高める目的で、輸送体タンパク質のN末端にGSTを融合して発現させるpCold GSTプラスミドにORFを乗せ換え、同様の解析を行った（ただしS. violaceaについては4個中2個について行った）。しかしながら、それら融合型輸送体はやはり沈殿画分に回収された。そこで次に、ホストの大腸菌をBL21株からC43株に変更した。C43株は膜タンパク質など大腸菌毒性のある場合に効果的と言われている。その結果、いずれの輸送体も260,000xgの超遠心を行った後にも上清に回収され、可溶化に成功した。これらはSDS-PAGE後、クマシーブルー（CBB）染色でバンドが確認できる程度に取得された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
BLAST検索によって、深海好圧性細菌のゲノムには予想外に多くのペプチド輸送体遺伝子がコードされていることがわかった。このことは、深海底での栄養源取得における新たな戦略として、ペプチドに着目することの意義を示している。しかし、ペプチド輸送体のように多数の膜貫通領域を持つタンパク質の精製は極めて困難である。今年度、最初の障壁である大腸菌内での輸送体発現とDDMによる可溶化に成功した意義は大きい。可溶性タグであるGSTの融合とホスト大腸菌をC43株に変更したことが鍵と考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
DDMにより各輸送体は可溶化されたが、それらが単量体として存在しているのか、あるいは多量体や凝集体を形成しているのかを知る必要がある。高次構造の崩壊が凝集体形成と相関する場合が多いため、標品は単量体として単分散していることが望ましい。そこで非変性ゲル電気泳動（Native PAGE）を行い、分子量から各輸送体の状態を推定する。DDMとミセル形成した膜タンパク質は、一般に予測値の2~2.5倍の分子量で電気泳動される。本研究で用いたペプチド輸送体はGST融合すると約90 kDaになるため、単量体として存在すれば200 kDa程度で泳動されるはずである。二量体や多量体を形成していればこれを上回る。Native PAGE ではCBBを電荷運搬体として用いた方法がよく用いられるが、ゲル全体が青く染色されるため、タンパク質の検出はウエスタンブロッティングによらざるをえない。しかし最近、Docusateという界面活性剤を電荷運搬体として用いた透明なゲル上でのNative PAGE法が開発された。そこで、これを用いた構造状態の確認や可溶化条件のさらなる検討を行う。適切な可溶化が確認された後、人工脂質を用いたペプチド輸送体の膜再構成系を構築する予定である。
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| Causes of Carryover |
当初は高圧培養容器を購入予定だったが、RT-PCRによるペプチド輸送体遺伝子の発現解析には至らず、次年度の購入とした。また、界面活性剤とアフィニティーカラムについては今年度の使用量が少なかったため、次年度の購入とした。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
高圧培養容器を購入し、高圧下におけるペプチド輸送体遺伝子の発現をRT-PCRによって解析する。また、各種界面活性剤とアフィニティーカラムを多数購入する予定である。
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Research Products
(4 results)
