2017 Fiscal Year Annual Research Report
High-Pressure adaptation in peptide transporters of deep-sea piezophiles
| Project/Area Number |
15K14698
|
|---|
| Research Institution | Aoyama Gakuin University |
|---|
Principal Investigator |
阿部 文快 青山学院大学, 理工学部, 教授 (30360746)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
|
| Keywords | 深海性細菌 / ペプチド輸送体 / トリガーファクターTF / 大腸菌内発現 / β-Ala-Lys (AMCA) |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度までに、深海性好圧性細菌Shewanella violacea DSS12株から4つのペプチド輸送体遺伝子をクローニングし、大腸菌C43株での発現系の構築、および6xHisタグによるアフィニティー精製を行った。輸送体に大腸菌シャペロンTrigger factor (TF)を融合することで、Native PAGEで立体構造の維持が確認された輸送体タンパク質標品が得られたが、人工脂質膜への再構成系構築には至らなかった。そこで本年度は、大腸菌を宿主として、ペプチド輸送体の活性測定系の構築に取り組んだ。今回はS. violacea DSS12株が持つペプチド輸送体の一つをPepTsv1と命名し、これに関する解析を行った。抗6xHis抗体を用いたウエスタンブロッティングを行ったところ、6xHis-PepTsv1の発現はほとんど見られなかった。一方、6xHis-TF-PepTsv1と6xHis-TF-GFP-PepTsv1では発現が見られた。そこで、蛍光ペプチドβ-Ala-Lys (AMCA) を基質として用い、15℃で両者におけるペプチド取り込み活性を測定した。その結果、6xHis-TF-PepTsv1発現株では、ベクターのみを保持する対照株と同様に蛍光ペプチドの取り込みは一切観察されなかった。ところが、さらにGFPを融合した6xHis-TF-GFP-PepTsv1発現株では経時的な蛍光ペプチド取り込み量の増大が見られた。このことは、S. violaceaの輸送体は大腸菌内で発現させると不安定化し、GFPがこれを安定化する可能性を示唆している。また、プロトンの脱共役剤であるCCCPが蛍光ペプチドの取り込みを大幅に阻害し、またAla-Trpを共存させた場合にも濃度に依存した阻害効果が見られたことから、PepTsv1がプロトン共役型のジペプチド輸送体である可能性を示唆している。
|
Research Products
(4 results)
