2015 Fiscal Year Research-status Report
酵母による選択的D-アミノ酸誘導体分泌システムの構築と発酵生産への応用
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15K14699
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| Research Institution | Ritsumeikan University |
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Principal Investigator |
若山 守 立命館大学, 生命科学部, 教授 (70240455)
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2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | D-アミノ酸 / N-アセチル－D-アミノ酸 / アミノ酸ラセマーゼ / D-アミノ酸アセチルトランスフェラーゼ / D-アミノアシラーゼ / 出芽酵母 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
D-アミノ酸は、近年、その生理作用が注目され、化学療法剤や食品添加剤としてもその重要度が増している。しかし、D-アミノ酸は非タンパク性アミノ酸であることから発酵生産は困難であり、その生産は有機化学合成法に依存している。本研究では、取り込んだD-アミノ酸をN-アセチル-D-アミノ酸へ変換した後、菌体外への分泌（排出）する酵母の特徴的な性質に着目し、酵母によるN-アセチル-D-アミノ酸の選択的分泌生産系の構築、および、生成したN-アセチル-D-アミノ酸からの酵素反応によるD-アミノ酸への変換系の構築を目的とした。
平成27年度全体計画のうち、以下に述べた研究を中心として成果が得られた。
Pseudomonas putida由来低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ遺伝子および乳酸菌Leuconostoc mesenteroides由来アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸に特異的なラセマーゼ遺伝子のうち、幅広いアミノ酸を基質とするP. putida由来低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ遺伝子、D-アミノ酸アセチルトランスフェラーゼ遺伝子ならびにD-アミノアシラーゼ遺伝子の大腸菌Rosetta gami B・pETベクター宿主ベクター系での高発現系の構築を行った。
一方、本D-アミノ酸生産系において生成するD-アミノ酸を迅速・簡便に定量するためのD-アミノ酸検出用D-アミノ酸オキシダーゼの開発を行った。土壌より新たに分離したAspergillus sp. GI-3株に2種類のD-アミノ酸オキシダーゼを見出し、両酵素の精製および諸性質を調べ、D-アミノ酸の迅速・簡便定量法を確立した。本D-アミノ酸オキシダーゼを利用したD-アミノ酸検出法により、in vitroにおける酵素系を用いたL-メチオニンからのD-メチオニン生成の確認を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
当初予定していた研究支援者の一部支援が受けられない状況が発生した点、ならびに実験スキル上の問題に伴い、予定通りに実験内容を次の段階に進めることが出来なかった点が理由としてあげられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ遺伝子とD-アミノ酸アセチルトランスフェラーゼ遺伝子で形質転換された出芽酵母S.cerevisiaeによるN-アセチル-D-アミノ酸の分泌生産の最適化と生成物分析を引き続き行っていく予定である。D-アミノアシラーゼとの共役系により生成するD-アミノ酸の分析を行なう。また、ゲノム配列を基にしたアミノ酸輸送体タンパク質遺伝子破壊酵母の作出を行い、出芽酵母S.cerevisiaeのN-アセチル-D-アミノ酸輸送体タンパク質の同定を行っていく予定である。
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| Causes of Carryover |
購入予定時の物品価格と購入時の実価格との差が次年度使用額が生じた理由
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
前年度の繰越金は消耗品として、試薬等の購入に当たる予定
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