2016 Fiscal Year Research-status Report
野生漢方薬原料植物カラスビシャクの迅速作物化の為の有効多糖成分合成遺伝子の同定
| Project/Area Number |
15K14711
|
|---|
| Research Institution | Kyushu University |
|---|
Principal Investigator |
松岡 健 九州大学, 農学研究院, 教授 (40222294)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
|
| Keywords | ゲノム / RNAseq / 生薬原料 / アラバン / アラビノース転移酵素 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
九州大学でコレクションした複数系統の中から、昨年度迄に見いだしていた最も生育の良い系統を材料に、根、塊根、葉、葉柄から、逆転写酵素の阻害因子を多量に含まず、また殆ど分解が起きていないRNAを抽出する条件を設定した。次いでこれらのRNAを鋳型として、RNAseq反応に供した。その結果、１００塩基の長さのcDNA断片の配列を、根、塊根、葉、葉柄のそれぞれ、４．３Gｂ、４．６Gｂ、４．７Gb, ４．４Gｂの長さ分を得た。現在、これらの配列情報の解析を進めている。
上記の最も生育の良い系統と、それ以外の1系統について、自殖種子を形成させる条件を見いだした。次いで、この条件により形成された種子を播種することで、最も生育の良い系統由来の後代個体を10個体以上、それ以外の１系統についても複数個体を獲得した。現在これらについて、生産性の検討の準備段階として、増殖を進めている。
昨年度、公開配列情報を下にアセンブルした2種のアラビノース転移酵素候補のうち、異種発現でアラビノースに富む糖鎖の合成が認められると報告されているもののオルソログをコードするcDNAのクローニングを、上記の最も生育の良い系統を出発材料として進めた。まず、RT-PCRにより、根，葉と塊茎にこの遺伝子オルソログの発現の可能性を示す結果を得た。次いでこれら産物のクローニングと配列解析を進めた。現在迄に解析の終了した根由来の2クローンは同一の配列を有しており、また昨年度アセンブルした配列より，１アミノ酸残基長いタンパク質をコードすることを見いだしている。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
アラビノース転移酵素候補に対するcDNAの獲得ができたことで、候補遺伝子産物の単離は順調に推移していると考えられる。
また、種子を経由した遺伝的多様性と遺伝子の伝達のための解析対象の獲得については、2系統で自殖条件を確立することが出来、またこれら自殖種子由来の個体も得ることが出来た為、概ね順調に推移していると考えられる。
RNAseq のデータ獲得については、高純度RNAの調製に手間取ったため、年度末まで時間を要してしまい、これについては計画より少し遅れていると考えられる。
以上を総合すると、本研究は概ね順調に進展していると考えられる。
|
| Strategy for Future Research Activity |
最も生育の良い系統を材料に、カラスビシャクの器官別アラバン含有量の検討を、モノクローナル抗体への反応性を指標に進める。また、RNAseqデータの解析を進め、上記アラバン含有量と相関のある発現を示す棟転移酵素候補の絞り込みを行う。
現在までに獲得したアラビノース転移酵素候補cDNAを、タバコ培養細胞で過剰発現させ、培地中に分泌される成分に、坑アラバン抗体反応性多糖が増大するかの検討を進める。また、培地中の多糖を回収し、それらにおける糖組成の解析を進めることで、獲得したcDNAがアラビノース転移酵素であるか、検討を進める。
自殖後代については、塊根におけるアラバン量の定量を行い、ばらつきが認められたら、そのばらつきと上記解析で見いだされた／る糖転移酵素の発現に相関があるか、検討を進める。
|
| Causes of Carryover |
RNAseqに要する費用を、ある業者におけるキャンペーン期間に外注することで、当初見積もりより安価に抑えることが出来た為、次年度使用額が生じた。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
最終年度に異種発現解析を終える為に、短期間バーとタイマーで実験補助を雇い、プラスミド作成等を進めている。この費用に、この次年度使用額は充当する。
|
