2015 Fiscal Year Research-status Report
脂質修飾サイクルを制御する新規脱ミリストイル化酵素の同定とその機能構造解析
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15K14712
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| Research Institution | Kyoto Gakuen University |
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Principal Investigator |
松原 守 京都学園大学, バイオ環境学部, 教授 (90288481)
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2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | ミリストイル化 / 脂質修飾 / シグナル伝達 / 脱ミリストイル化 / 酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
タンパク質のミリストイル化は、これまで不可逆的な脂質修飾と考えられており、ミリストイル基を除去する脱ミリストイル化酵素は同定されていない。ミリストイル化タンパク質の多くは細胞内のシグナル伝達系を担っている重要なものが多く、更に細胞のがん化、ウイルス感染などに深く関わっているので、ミリストイル化タンパク質の制御に関わる脱ミリストイル化酵素の存在を明らかにすることは大きな発見である。
本研究では、脱ミリストイル化酵素を精製、同定し、その酵素学的性質、細胞内におけるミリストイル化の可逆的なメカニズムを明らかにする。また、脱ミリストイル化酵素の脱ミリストイル化活性を利用した各種疾患における治療薬開発の可能性についても検討する。
本年度は、脱ミリストイル化活性を検出するアッセイ系の開発に重点をおいた。当初はミリストイル化認識抗体を用いてのELISAアッセイ系を確立する予定であったが、抗体の作成等の時間がかかるので、電気泳動によりミリストイル化タンパク質とミリストイル化されていないタンパク質の違いを分離することにした。結果的にNativeゲル電気泳動法によって両者を分離することができることが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
脱ミリストイル化活性を検出するためのアッセイ系を開発する必要があり、当初ミリストイル化を認識する抗体を用いてアッセイ系を作成する予定であった。しかし、ミリストイル化抗体の作成は難しくかつ時間がかかること。またコスト的にも高くなるので、方針を変えて電気泳動法によってミリストイル化タンパク質とミリストイル化されていないタンパク質を識別することにしたため計画が遅れてしまった。
最終的にNativeゲル電気泳動法によって精製したミリストイル化NAP-22とミリストイル化されていないNAP-22を識別することができた。この方法を用いてアッセイ系を開発するとともに、さらに効率的なアッセイ系を見出していく。
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| Strategy for Future Research Activity |
Nativeゲル電気泳動法によって精製したミリストイル化NAP-22とミリストイル化されていないNAP-22を識別することができたので、この方法を用いて脱ミリストイル化酵素のスクリーニングを行う。更に新しいアッセイ系としてクリックケミストリーの方法を用いてラベル化されたミリストイル化をタンパク質に導入することにより、ミリストイル化されたものとされていないタンパク質を迅速に識別する方法も開発する予定である。
これらの方法を用いてラット脳画分より脱ミリストイル化酵素を精製する。現在までの予備的な実験から、若齢ラット（8～10週齢以内）の脳細胞質画分を回収後、30%硫安で沈殿させた画分にATP依存的に脱ミリストイル化活性が存在することが分かっている。この画分からイオン交換カラム、ゲル濾過カラムなどを用いて脱ミリストイル化活性を示す酵素画分を回収し、SDS-PAGE上で単一バンドまで精製する。
電気泳動で分離したタンパク質は、in gel digestionを行い、質量分析計を用いて解析する。得られたデータをデータベース検索にかけタンパク質名を同定する。既にラットでは全ゲノムが分かっているので、精製したタンパク質の質量分析解析で同定できることが予想されるが、もしこの方法で出来なかった場合は、部分配列をプロテインシークエンサーで読み、その情報から遺伝子クローニングすることによって脱ミリストイル化酵素を同定する。
得られたタンパク質の配列情報をもとにヒトホモログやドメイン構造を明らかにし、更にバイオインフォマティクス的手法を用いて機能構造を予測する。
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| Causes of Carryover |
学会出張や研究打ち合わせによる旅費の支出が当初より減ったこと。およびその他の支出(論文校正料など）も減り、その分の差額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
物品費が予想以上にかかるので少しその部分に使用することと、学会出張による支出と論文校正料に使用する。
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