2016 Fiscal Year Research-status Report
| Project/Area Number |
15K14738
|
|---|
| Research Institution | Ishikawa Prefectural University |
|---|
Principal Investigator |
小西 康子 石川県立大学, 生物資源環境学部, 教授 (80129238)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小椋 賢治 石川県立大学, 生物資源環境学部, 教授 (50270682)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
|
| Keywords | 呈色反応 / 酵素反応 / ペプチド |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
申請者らは、チロシナーゼとチロシン残基を含むペプチドとの反応を研究する過程で、アミノ酸共存下で反応を行ったのち凍結保存すると、反応液は様々な色を呈するようになることを見出した。しかし、本反応の詳細は不明である。一方、緑色は食品を美しく彩り、その魅力を増して食欲をそそる色合いとして好まれ、多くの食品に利用されている。消費者の安全性志向から天然系色素の使用が求められている中で、緑色に関しては不安定なクロロフィル以外の天然型色素は無いのが現状である。本研究では、メラニンのように赤や茶といった色しか知られていなかったチロシナーゼの酵素化学反応を利用し、緑を中心とした、食品に使える様々な色素を作り出す技術を開発することを目的としている。平成27年度では、モデルペプチドとして、チロシン残基を１つ含みN末端がアセチル化されたトリペプチド（Ac-YVG）とチロシナーゼを、グリシン共存下で反応させて生じた青色反応溶液から呈色物質を精製してH-NMR解析を行ったが、構造を特定することができなかった。
平成28年度は、新たな知見を得るために、アミノ酸20種類とAc-YVGペプチドをpH条件を変えて反応させたところ、種々の呈色反応液が得られた。その中では、pH 8.7で脂肪族系アミノ酸（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン）を用いた場合に、安定した青色反応液が得られた。C18カラムを用いてピークをそれぞれ1～3つずつ分離精製したところ、赤色蛍光を示すものと蛍光がないものがあることが分かった。高性能質量分析により構造解析を行った結果、脂肪族系アミノ酸5種類を用いて調製した青色呈色物質は、アミノ酸の部分は違うが基本構造は同じであることがわかった。また、赤色蛍光を示す構造と、蛍光がない構造の基本構造の違いも明らかにすることができた。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本呈色反応では、Ac-YVGペプチド中のチロシン残基がチロシナーゼにより酸化されて生成した反応性の高いドーパキノンに、アミノ酸のアミノ基が結合して色素が形成されると考えていたが、その構造は不明であった。初年度はアミノ酸としてグリシンを用いて青色色素の形成を行っていたが、構造決定には至らなかったことから、次年度の平成28年度では20種類のアミノ酸で同様の反応が起こるかどうかを検索して新たな情報を得ることにした。
pHによって反応液の色調は異なるが、C18カラムで分離される基本ピークは同じであったことから、形成される物質の種類は同じであり、その比率が異なるだけであることがわかった。たとえば緑色の反応液は、青色と黄色の呈色物質の混合により緑色に見えるということである。そこで、一連の脂肪族系アミノ酸（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン）を用いて生成した青色反応液から青色呈色物質を精製し、吸収スペクトルと蛍光スペクトルを測定し、精密質量分析を実施して比較検討を行った。その結果、これらの青色呈色物質の基本構造は、一連の脂肪族アミノ酸の側鎖は異なるが、アミノ酸3つとペプチド1つが複素環を形成している同じ構造であることが分かった。また、強い赤色蛍光の有無についても、構造の違いを明らかにすることができた。本研究の目的の1つである、ペプチドとアミノ酸から酵素反応を利用して作り出した新しい呈色物質の構造を提示することができた。
|
| Strategy for Future Research Activity |
1.呈色物質生成の反応メカニズムを明らかにする： 凍結時間を変えて得られた青色呈色物質を分離精製し、精密質量分析により構造解析を行うことで、凍結中に進行する点が非常にユニークである本呈色反応の特徴を明らかにし、反応メカニズムを提唱する。
2.新たな呈色物質を調製する： 食品タンパク質を基質として、種々のアミノ酸存在下でチロシナーゼを作用させたのち凍結する。呈色反応がおこる条件を検討し、新たな呈色反応物質の調製を行う。
|
| Causes of Carryover |
呈色物質の構造解析においてNMR測定ではなく、質量分析測定を行ったことから計画が変更になり、次年度使用額が生じた。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
ペプチド、溶媒、実験消耗品、委託分析費用に使用する。
|
