RNA干渉法を用いた母性mRNAノックダウンによる不稔化エゾアワビ種苗の作出

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K14802
• Research Institution: Kagoshima University
• Principal Investigator: 竹内 裕 鹿児島大学, 農水産獣医学域水産学系, 助教 (70418680)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: RNA干渉 / 海産無脊椎動物 / アワビ類 / 生殖細胞 / vasa / RNA-seq

Outline of Annual Research Achievements

アワビ養殖において春・秋の産卵期は鬼門であり、2歳（殻長7cm）以上の個体では、産卵期は身痩せしハンドリングに弱くなるうえ、水揚げ後に卵巣が肥大化し大量蕊死する例が知られている。さらに、アワビ人工稚貝は、天然稚貝とは異なり、1歳（殻長4cm）でも排卵・排精が可能なまでに成熟する。そこで、本研究では、性成熟に起因する成長停滞や斃死を回避することで高成長・高生残な養殖用品種を開発するため、RNA干渉法を用いたアワビ不稔化技術の開発を行なっている。
H28年度は、アワビ生殖腺および未受精卵を用いたトランスクリプトーム解析から、RNA干渉によるアワビ不稔化を達成するための新たな標的遺伝子（生殖細胞関連遺伝子）の候補を探索した。エゾアワビ受精卵内に蓄積される母性RNA（1315遺伝子）のなかから、他の生物種で生殖細胞の形成に関与することが報告されている遺伝子のリストを参考に、9個の候補遺伝子を選定した。これらの遺伝子の詳細な発現解析を行い、1つの遺伝子（ZP12遺伝子）が、エゾアワビの初期生殖細胞で特異的に発現していることを明らかにした。現在、当該遺伝子のRNA干渉によるノックダウン（平成27年度に方法を確立）を行い表現型の解析を行っている。また、卵母細胞に対するRNA干渉の効果を判定する方法として、DAPI染色が有効であることを確認した。ダメージを受けた卵母細胞内には、有核の血液細胞が浸潤し、卵黄成分の再吸収を行うことがマガキを用いた先行研究において報告されている。しかし、血液細胞の浸潤は通常の組織観察では判定できない。そこで。アワビ卵巣の組織切片をDAPI染色することで、RNA干渉を行った個体の卵母細胞内に血液細胞の浸潤が起こるか否かを判定する方法を開発した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ＲＮＡ-ｓｅｑアワビ法を用いて生殖細胞で発現する遺伝子のカタログ化を行い、複数の候補遺伝子を選定した。アワビにおいて、ＲＮＡ干渉技術を用いた母性ＲＮＡノックダウン法を開発した。しかしながら、母性ＲＮＡノックダウンによる生殖細胞を欠損個体の作出には至っておらず、標的遺伝子を変更して実験を継続している。

Strategy for Future Research Activity

RNA干渉の標的遺伝子の変更：これまでRNA干渉の標的として用いてきたvasa遺伝子は、広範の動物種において生殖細胞に特異的に発現する遺伝子であることが知られているが、無脊椎動物および魚類の初期胚では腹側の分化に関与することも知られており、本研究におけるRNA干渉の効果がアワビ胚の形態形成異常を引き起こし、生残性の不稔化個体が得られにくい状況を生み出している可能性がある。そこで、RNA干渉の標的遺伝子を母性mRNAのみに限定することなく、より生殖細胞に限局して発現する遺伝子を標的とすることで、不稔化個体の生産効率の向上を実現したい。新たな候補遺伝子として、dnd遺伝子およびZP12遺伝子のアワビホモログに対するRNA干渉試験を実施し、その効果を判定する。効果の判定には、H27年度に開発したDMC1抗体染色法およびH28年度に開発した卵巣のDAPI染色法を用いる。