microRNAによる放牧牛の骨格筋特性の解明とマーカーの開発

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K14849
• Research Institution: National Agriculture and Food Research Organization
• Principal Investigator: 林 征幸 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 畜産研究部門, 研究員 (80355106)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 室谷 進 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 畜産研究部門, 研究員 (50355062) ; 柴田 昌宏 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 近畿中国四国農業研究センター, 研究員 (60370631)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 放牧 / 血中microRNA / 網羅的解析 / 黒毛和種 / 肉用牛

Outline of Annual Research Achievements

16ヶ月齢黒毛和種去勢牛(n = 8)を放牧区(n = 4)と舎飼区(n = 4)に無作為に割り振った。23ヶ月齢まで放牧区は放牧し、舎飼区は舎飼して慣行的な濃厚飼料主体の飼料を給与した。22ヶ月齢時にEDTAを含む採血管で採血を行い血漿を得た。血漿を超遠心分離し、沈殿物よりmicroRNA画分を得た。miRBase ver 21を元にカスタムマイクロアレイをデザインし（SurePrint G3 8x60K (Agilent)）、これを使用してmicroRNAの網羅的発現解析を行った。血中microRNAのマイクロアレイ解析により202のウシ血漿中microRNAを検出でき、そのうち15に舎飼区と放牧区の間での発現量に有意な差が見られた(P < 0.05)。舎飼区ではbta-miR-652、bta-miR-30d、bta-miR-301a、bta-miR-345-5p、bta-miR-374b、bta-miR-425-5p、bta-miR-23b-3p、bta-miR-30b-5p、bta-miR-17-5p、bta-miR-98、bta-miR-28およびbta-miR-874の発現が高く、放牧区ではbta-miR-2368-3p、bta-miR-885およびbta-miR-2425-3pの発現が高かった。
黒毛和種を含めたウシにおいて、放牧と舎飼という飼養条件の違いが血中miRNA発現プロファイルに影響を与えるという報告は今までなく、生理学的な意義は大きい。本結果は放牧牛と舎飼牛の生理状態の違いについての基礎的な知見として重要である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

動物実験は予定通りに進行し、サンプルも得られている。また、放牧が黒毛和種の血中microRNAプロファイルに与える影響を明らかに出来ており、当初計画していた成果が得られている。

Strategy for Future Research Activity

マイクロアレイ法による血中microRNA網羅的解析によりスクリーニングされた放牧により発現量が変化する血中microRNAについて、リアルタイムPCRで定量し網羅的解析の結果を確認する。変動したmicroRNAの標的遺伝子の予測、その標的遺伝子群が関与する細胞・分子生物学的現象をバイオインフォマティクス（遺伝子オントロジー解析や機能的アノテーション法）により解析する。これにより放牧で変動する血中microRNAがどのようなパスウェイで作用するのかを推定する。
と畜までの骨格筋組織（筋肉内脂肪を除去）でのmicroRNAおよびmRNAの発現を調べる。血中変動の大きいmicroRNAとその標的と予測される遺伝子、および骨格筋特異的遺伝子（肉質関連を含む）を対象として、それらの発現を定量的PCRで解析する。
肥育終了後の出荷時（約28ヶ月齢）に、枝肉特性データ（皮下脂肪厚、ロース芯面積、枝肉重量等）を取得する。得られた枝肉特性データと一連の分子生物学的な解析結果の関連について検討し、放牧が枝肉評価や格付、肉質に及ぼす影響やメカニズムを考察する。同時に脂肪交雑など枝肉評価や放牧とmicroRNAとの関連を検討する。