2017 Fiscal Year Research-status Report
植物と昆虫に共通した共生戦略分子としてのシステインリッチペプチドの機能
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15K14899
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| Research Institution | Kagoshima University |
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Principal Investigator |
内海 俊樹 鹿児島大学, 理工学域理学系, 教授 (20193881)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | ブフネラ / アブラムシ / 共生 / システインリッチペプチド / マメ科植物 / 根粒 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、アブラムシ体内のバクテリオサイトとよばれる共生器官に存在するシステインリッチペプチド（バクテリオサイト特異的システインリッチペプチド＝BCR）が、細胞内共生細菌であるブフネラとの共生に必須かどうかを明らかにすることを目的としている。本研究では、ふたつのサブテーマを展開しており、本年度の実績は、次のとおりである。
１．BCRの生理活性の解明
エンドウヒゲナガアブラムシが保持する7種のBCRのうち、合成可能であった6種のBCRについて、大腸菌MG1655、及び、BW25113を被験菌株として抗菌活性を検討した。その結果、BCR1, 3, 5, 8（終濃度5 microM）に強い抗菌活性が検出された。根粒菌の場合、宿主植物の根粒特異的システインリッチペプチド（NCR）に対する感受性には、bacA遺伝子が関与している。そこで、BW25113由のsbmA遺伝子（根粒菌のbacAタンパク質と88%の類似性を示す）変異株であるJW00368を被験菌株として抗菌活性を検討した。その結果、JW0368は、いずれのBCRに対しても感受性がより高いことが判明した。また、JW0368は、NCRに対しても、より感受性が高かった。これらのことから、大腸菌も根粒菌も、ともに膜タンパク質BacAおよびSbmAが重要な役割をもつと考えられる。
２．BCR が共生に必須な分子であることの証明の試み
本研究では、植物を介して合成RNAをアブラムシに取り込ませ、BCR遺伝子の発現を抑制し、その効果を検討することを計画している。本年度は、予備実験として、ブフネラが感受性を示すリファンピシンを使用した。ソラマメなどの葉柄からアブラムシにリファンピシンを摂取させ、生存率、及び、繁殖率より、その効果を評価する実験系を確立した。また、人工飼料を用いた実験系も確立し、合成RNAによるRNAi実験の準備が整った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
現在までに、大腸菌、及び、根粒菌を被験菌とした合成BCRの抗菌活性については、ほぼ検討を終了した。恐らくは、BCRの構造的な特性によるものと考えられるが、活性の低下や実験結果の再現性に難があり、その解決法の検討で予想外の時間がかかってしまった。最終的には、合成BCRを定期的にリフォールディング処理することにより、信頼性の高い実験結果を得ることができた。しかしながら、BCRの標的分子を同定する試みまでには至っていない。
宿主アブラムシのBCR遺伝子の発現抑制が、共生菌ブフネラに及ぼす影響を明らかにすることも重要な課題である。植物を介して色素、及び、抗生物質をアブラムシに摂食させる方法の検討は、順調に進行した。しかし、植物を介した方法では、試薬の供給量が相当量必要であることが判明し、人工飼育による方法を検討せざるを得なくなった。本年度は、飼育方法の習得のみならず、生存率や繁殖率などの基礎データの取得、抗生物質の効果の評価法など、実験系の構築に時間を割くこととなった。RNAi用のRNAは合成が終了しており、実験の準備が整ったところである。しかし、RNAiの効果については、発現量や組織学的な観察による評価法の検討が、これからの重要な課題として残っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
基本的な推進方策に変更はない。ただし、ふたつのサブテーマのうち「１．BCRの生理活性の解明」については、BCRの標的分子を同定する試みは今後の重要課題とし、これまでの実験結果を精査することを中心としたい。もうひとつのサブテーマ「２．BCRが共生に必須な分子であることの証明の試み」は、RNAiによって生体内でのBCRの機能の解明を試みる本研究の核心となる取り組みであり、実験の遂行に集中したい。当初は、植物を介してアブラムシに合成RNAを摂取させる計画であったが、人工飼育による方法で実施することとする。研究の進捗はやや遅れているが、合成RNAを摂食したアブラムシの生存率や繁殖率、各BCR遺伝子の発現量、バクテリオサイトとブフネラの顕微鏡による観察については実験を終了し、信頼できる結果を得ることを目標とする。
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| Causes of Carryover |
研究の進捗遅れにより、本年度はRNAi用のRNAを合成するところまでとなったため、RNAiの効果の評価、及び、連携研究者との研究打ち合わせは、次年度に実施することとした。平成30年度の経費は、合成RNAを用いた実験を実施し、発現抑制の効果を定量PCRで評価する際に使用するプライマーの合成、及び、メカニカルピペットのチップの購入に充てる予定である。また、研究のまとめについて打ち合わせを実施するため、連携研究者研究の招へい旅費として使用する。
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Research Products
(2 results)
