2016 Fiscal Year Annual Research Report
Development of an RNA binding protein-based tool for manipulating organelle RNA function
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15K14917
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
杉田 護 名古屋大学, 遺伝子実験施設, 教授 (70154474)
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2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | RNA結合タンパク質 / PPRタンパク質 / RNA編集 / RNA分解 / RNA結合モチーフ / NYNドメイン / 葉緑体 / ヒメツリガネゴケ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Pentatricopeptide repeat （PPR）タンパク質のRNA結合モチーフを改変したカスタムPPRタンパク質をデザインし、RNA編集部位の認識機構の解明および任意のRNA部位を認識するカスタムPPRタンパク質をベースした新規実験系を開発するための基礎研究を行った。２年間で得られた成果は以下の通りである。
(1) RNA編集PPRタンパク質はP, L, Sの３種類のモチーフで構成されているが、PモチーフとSモチーフそれぞれの5番目と35番目のアミノ酸の組み合わせで１塩基を認識するが、Lモチーフは塩基認識に寄与しないとこれまで考えられていた。ヒメツリガネゴケのRNA編集タンパク質PpPPR_56は14個のPPRモチーフがLSPLSPLSPLSPLSの順に並んでいる。本研究で、PpPPR_56のそれぞれのモチーフの5番目と35番目のアミノ酸殘基を置換した多数の変異PpPPR_56をPpPPR_56 遺伝子破壊変異株で発現させ、２カ所の編集部位（nad3-C230とnad4-C272）のRNA編集効率を比較定量した。その結果、C末端側に位置する10番目と13番目のLモチーフに変異を導入すると、nad4-C272部位の編集効率が野生株レベルに回復したが、nad3-C230部位のRNA編集効率が30-45％程度にしか回復しなかった。この結果は、Lモチーフが編集部位の認識に重要な寄与をしていることを強く示唆する重要な発見である。
(2) 最終年度に葉緑体のpsbA RNAを認識するようにデザインしたカスタムPPRタンパク質を作製し、そのC末端にN4BP1, YacP-like Nuclease (NYN)ドメインを融合させたカスタムPPR-NYNタンパク質を調製することに成功した。このPPR-NYNタンパク質がpsbA RNAを効率よく分解することを試験管内で観察した。現在、カスタムPPR-NYN遺伝子を導入した形質転換ヒメツリガネゴケ植物の作出を行っている。
本研究で得られた成果を基盤として、今後も「RNA機能を調節する新しい実験系」の開発を続ける予定である。
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