2017 Fiscal Year Annual Research Report
Construction of novel membrane-bound molecular probes for lytic granulces and their functional analysis
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15K14920
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| Research Institution | Kyoto Institute of Technology |
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Principal Investigator |
片岡 孝夫 京都工芸繊維大学, 応用生物学系, 教授 (20242307)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | perforin / SLC3A2 / eomesodermin / interferon-γ / LAMP1 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒトナチュラルキラー(NK)細胞株YTN-10細胞から限界希釈法を用いて、シングルセルからの増殖が可能な複数のクローンを単離した。さらに、これらのYTN-10細胞クローンにおける内在性のperforinの発現量とエレクトロポレーションによる遺伝子導入効率を検討したところ、野生型YTN-10細胞と比較して、内在性パーフォリンの発現量は同程度であるが、高い遺伝子導入効率を有するYTN-10細胞クローンが得られた。
SLC3A2は細胞傷害顆粒画分に含まれていることが報告されている膜タンパク質である。YTN-10細胞のcDNAライブラリーから、SLC3A2遺伝子をクローニングした。ヒト胎児腎HEK293T細胞において、SLC3A2-EGFPを発現させたところ、分子量88-113 kDaに相当するバンドとして観察された。さらに、ヒト肺がん腫A549細胞において、SLC3A2-EGFPとLysoTracker DND-99が部分的な共局在を示すことが観察された。
T-box転写因子eomesoderminは、細胞傷害性T細胞やNK細胞において、細胞傷害活性やinterferon-γ (IFN-γ)の発現に関与している。Eomesoderminを発現させたマウスリンパ腫BW5147細胞において、IFN-γ遺伝子座にあるIfngプロモーター及び複数のconserved noncoding sequencesへのNF-κBサブユニットRelA及び NFATc2の結合がeomesoderminによって促進されることを見出した。
ゴールデンハムスター腎由来BHK-21細胞におけるLAMP1の細胞内局在を検討した。BHK-21細胞にLAMP1-EGFPをトラスフェクションした後、LysoTracker DND-99で染色し、超解像顕微鏡で観察したところ、LAMP1-EGFPとLysoTracker DND-99が共局在しないことが確認された。
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