2015 Fiscal Year Research-status Report
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15K14958
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science |
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Principal Investigator |
佐伯 泰 公益財団法人東京都医学総合研究所, 生体分子先端研究分野, 副参事研究員 (80462779)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | ユビキチン / プロテアソーム / タンパク質分解 / プロテオミクス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
プロテアソームはユビキチン化タンパク質を選択的に分解する細胞内の巨大なタンパク質分解装置であり、ほぼ全ての生命現象に必須の役割を果たしている。これまで、ヒトプロテアソームサブユニットGFPノックイン細胞を用いた解析より、プロテアソームは増殖中の細胞では主に核に局在化すること、カルシウムイオノフォア刺激により核外に輸送されることを見出している。一方、出芽酵母では増殖期においてプロテアソームは核に局在するが、休止期ではプロテアソームは細胞質に局在し1～3個の顆粒構造をとる。本研究では、これらの現象を利用し、全くの不明であるプロテアソームの核外輸送の分子機構を明らにすることを目的としている。平成27年度は、プロテアソームの核外輸送担体を同定するため、プロテオミクス解析によるプロテアソーム結合タンパク質の単離と酵母ノックアウトライブラリーを用いた解析を試みた。プロテアソームはATP依存性プロテアーゼであり、一般的なアフィニティー精製条件では結合タンパク質の解離や基質タンパク質の分解が起こる。そこで、低濃度のホルマリン固定により、結合タンパク質を安定に同定する方法を開発した。質量分析計を用いた半定量解析の結果、新規の分子を含む約50個のプロテアソーム結合タンパク質が同定され、カルシウムイオノフォア刺激により増加あるいは減少する複数の分子を同定した。一方、出芽酵母遺伝子ノックアウトライブラリーを用いて休止期にプロテアソームの核外移行に欠損を示す株の探索を行い、プロテアソーム顆粒の形成に異常を示す株を単離した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
プロテアソームの核外輸送担体の同定を目的とし、プロテオミクス解析によるプロテアソーム結合タンパク質の単離と酵母ノックアウトライブラリーを用いた解析を試みた。
（１）プロテオミクス解析によるプロテアソーム結合タンパク質の単離
低濃度のホルマリン（終濃度0.5%）により細胞を固定した後、プロテアソームサブユニットGFPノックイン細胞からプロテアソームをアフィニティー精製し、脱架橋後、LC-MS/MS解析に供した。固定操作により、新規の分子を含む約50個のプロテアソーム結合タンパク質が同定された。半定量解析により、カルシウムイオノフォア刺激により増加あるいは減少する分子を探索したところ、既知のユビキチンリガーゼやシャトル分子のほか、輸送担体の候補となる機能未知の分子を複数同定した。
（２）出芽酵母遺伝子ノックアウトライブラリーを用いたスクリーニング
プロテアソームサブユニットにGFPをノックインした遺伝子ノックアウトライブラリーを作製し、休止期においてプロテアソームの核外移行に欠損を示す株の探索を行った。その結果、核外移行に明確な欠損をもつ株は得られなかったが、プロテアソーム顆粒の形成に欠損を示す株を複数同定した。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成27年度に得られたプロテアソームの核外輸送担体候補分子について、以下の解析を実施する。
（１）ヒトプロテアソームGFPノックイン細胞を用いた解析
LC-MS/MS解析により同定された候補分子について、GFP融合コンストラクトを作製しカルシウムイオノフォアによる局在変化を解析すると共に、siRNAノックダウンによりプロテアソームの核外輸送が阻害されるか解析する。次いで、候補分子が認識するプロテアソームサブユニットの同定、ドメイン解析等を実施する。
（２）ヒトプロテアソームGFPノックイン細胞を用いた解析
遺伝子ノックアウトライブラリーを用いたスクリーニングにより得られた候補分子について、結合分子にプロテアソームサブユニットが含まれるかLC-MS/MS解析を行う。次いで、候補分子が認識するプロテアソームサブユニットの同定、ドメイン解析、局在解析等を実施する。
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| Causes of Carryover |
プロテアソーム核外輸送担体の二次スクリーニングに用いるsiRNAの納品が若干遅れ、平成28年度納品となったため
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
使用計画の変更はなく、予定通りプロテアソーム核外輸送担体の二次スクリーニングを実施する。
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