2015 Fiscal Year Research-status Report
光機能性人工ナノ粒子を用いた細胞内PGE2受容体の機能解明とその応用
| Project/Area Number |
15K14966
|
|---|
| Research Institution | Nihon University |
|---|
Principal Investigator |
伊藤 芳久 日本大学, 薬学部, 教授 (50151551)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
須川 晃資 日本大学, 理工学部, 助教 (40580204)
小菅 康弘 日本大学, 薬学部, 助教 (70383726)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
|
| Keywords | ALS / PGE2 / 細胞分化 / ナノ粒子 / 神経突起 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
筋萎縮性側索硬化症(ALS)は、運動ニューロンの選択的な変性を特徴とする極めて予後不良の疾患で、発症メカニズムも不明のままである。ALS患者の脳脊髄液中では、健常者と比較してprostaglandin E2 (PGE2)のレベルが高いことが報告されている。PGE2は細胞膜に存在するPGE2受容体と結合して作用を示すと考えられているが、細胞内にもPGE2受容体が存在することが報告されている。しかし、細胞内受容体の機能については不明なままである。本研究では、最新の高分子化学及び光化学を応用し、エンドサイトーシスにより細胞内に導入され、内包物質を放出する光機能性人工ナノ粒子を開発することで、運動ニューロンの細胞内PGE2受容体の生理機能や疾患発症・進行における役割を解明するとともに創薬応用の可能性について明らかにする。
本年度は、神経細胞に適用可能なドラッグデリバリーキャリアとして、ナノ化されたグラフェン酸化物の合成を行い、その放出特性を解析した。また、運動ニューロンのモデル細胞であるNSC-34細胞を用いて、PGE2が細胞分化に及ぼす影響を検討した。その結果、NSC-34細胞では、PGE2はEP受容体を活性化することで運動ニューロンへの分化を促進することが明らかとなった。さらに、これまで検討が行われていなかった運動ニューロンに発現するEP3受容体の Isoformについても解析し、運動ニューロンではEP3γが選択的に発現していることを見出した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
本年度は、神経細胞に適用可能なドラッグデリバリーキャリアとして、ナノ化されたグラフェン酸化物を検討した。まず、グラフェン酸化物シートを強酸化処理することにより平均粒子径50 nmのナノ化に成功した。これに分岐PEG鎖を修飾することで生体親和性、バッファー分散性を付与可能であることを確認した。モデル薬剤としてドキソルビシンをキャリアに導入後、pH7.4環境下と比して、pH4.7において薬剤の放出効率が飛躍的に高まる（45 %）ことを見出した。エンドソーム内における薬剤の効率的放出が期待できる。
また、運動ニューロン様株細胞であるNSC-34細胞を用いて、PGE2及びその受容体が運動ニューロンの分化に及ぼす影響を検討した。PGE2 およびEP2選択的刺激薬であるbutaprost曝露は、NSC-34の細胞増殖を抑制するとともに、神経突起の伸長を誘発し、運動ニューロンへの分化を促進させた。しかし、 EP1/EP3選択的刺激薬であるsulprostoneは顕著な作用を示さなかったため、PGE2はEP2活性化を介し、NSC-34の神経突起の伸展や運動ニューロンへの分化を促進することが示唆された。
さらに、運動ニューロンに発現するEP3受容体の Isoformについても解析し、運動ニューロンではEP3γが選択的に発現していることを見出した。
このように、PGE2受容体 Isoformの同定やPGE2が運動ニューロンの分化を制御するという新たな知見を得ることに成功したため、当初の計画以上に進展しているとした。
|
| Strategy for Future Research Activity |
次年度は、金属ナノ粒子／刺激応答性高分子複合体の細胞移行性及び細胞毒性の評価を中心に行う。複合体の細胞内移行性を確認するために、Cy3などの蛍光指示薬を内包させた複合体を作成し、共焦点レーザー顕微鏡にて、NSC34細胞内に移行する蛍光指示薬の量や細胞内分布 (細胞小器官の中まで導入可能か)を解析する。
また、合成した複合体をNSC34細胞の培養液中に曝露し、生存率に及ぼす影響を解析することで、本研究で使用するナノキャリアの侵襲性を評価する。なお、生存率及び細胞障害の測定には、MTT法、LDH法及びTUNEL法を用いる予定である。
|
| Causes of Carryover |
金属ナノ粒子／刺激応答性高分子複合体の安定的な合成法の開発に苦慮したため、本年度に行う予定であった金属ナノ粒子／刺激応答性高分子複合体の細胞移行性及び細胞毒性の評価の一部を行えなかったため。
なお、現在は複合体の合成を安定的に行うことに成功しており、次年度以降の検討には利用可能である。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
NSC-34細胞を用いて、合成した複合体の細胞移行性及び細胞毒性を中心に行う。そのため、研究費は複合体の合成に必要な関連試薬、培養に使用する消耗品代、細胞生存率(MTT, LDH, TUNEL法)を評価する試薬の購入に使用する。
|
Research Products
(6 results)
