RNA結合タンパク質の特異的RNA認識を利用した細胞センサーの構築

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K14987
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 秋光 信佳 東京大学, アイソトープ総合センター, 教授 (40294962)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: RNA結合タンパク質

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、生細胞での遺伝子発現（RNAの発現誘導）をリアルタイム検出できる細胞センサーの開発を目指す。具体的には、検出対象となるRNAの塩基配列を特異的に認識できるようにデザインした“PUM1タンパク質RNA結合ドメイン”と“再構成型蛍光タンパク質（N末とC末の2つに分断された蛍光タンパク質が空間的に隣接することで蛍光発光活性を再構成できる蛍光タンパク質）”を連結したキメラタンパク質を構築して、細胞を生かした状態で検出対象のRNA発現を自在に検出するシステムを構築する。PUMタンパク質は、特異的な8塩基を認識できるRNA結合タンパク質である。
本研究開発を行う前提として、既知のPUM結合配列が生細胞の中でもPUMによって特異的に認識・結合することである。しかしながら、PUM結合配列はin vitro実験によって確認されたものであるため、生細胞中でも既知のPUM結合配列が確かにPUMによって特異的に認識されるかについては不明な点があった。そこで、初年度は、PUMが特異的に結合する内在性mRNAの同定を試みた。具体的には、PUMと結合するmRNAを免疫沈降法で回収して、回収物から抽出したRNAを次世代シーケンス解析した。次に、回収されるRNAに特異的に存在するRNA配列モチーフをMEMEプログラムで解析することでPUMがin vivoで結合するRNA配列の同定を調べた。その結果、従来知られていたRNA配列に加えて、異なるRNA配列がPUMによって認識されることが分かった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

PUM結合配列として、新規配列を同定できた可能性があるため、概ね順調に進捗していると判断した。

Strategy for Future Research Activity

初年度に同定したPUM標的mRNAの配列解析から、従来知られていたPUM結合配列とは異なる配列もPUMに結合していることが示唆された。これはPUMの結合特異性が細胞内では異なることを示唆している。結合特異性はPUMを使ったmRNAプロービングに極めて重要なポイントであるため、引き続き、PUMの特異的結合配列を決定する作業を行う。

Causes of Carryover

研究の進展によってPUMの特異的結合配列が従来とは異なることが示唆されたため、PUM-HD mutantsライブラリーの構築が予定より遅れたため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

次年度早々にPUM-HD mutantsライブラリーを構築し、予定予算を使用する予定である。