2016 Fiscal Year Annual Research Report
Development of a comprehensive drug transporter identification method by gene knockout
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15K14998
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
楠原 洋之 東京大学, 大学院薬学系研究科(薬学部), 教授 (00302612)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | トランスポーター / CRISPR-Cas9 / 遺伝子ノックアウト / ほ乳類細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ほ乳類細胞でのCRISPR-Cas9システムによる遺伝子発現抑制をトランスポーターの同定ツールとして確立することを目的として研究を行った。昨年度、KO細胞の選択方法をGFP発現に切り替えたが、コロニーの取得に至らなかった。そこで、レンチウイルスは100%感染しているとし、puromycinでセレクション後の細胞を、ポピュレーションの状態で使用することにより解決することを目指した。その結果、対象遺伝子の発現の顕著な低下、タンパクおよび輸送機能の低下を確認したことから、本方法を用いてトランスポーター機能を探索することが可能であることを確認した。当初の目的を達成するべく、SLC35Fに属するオーファントランスポーターを対象として、HEK293T細胞を宿主細胞とした解析を実施した。HEK293T細胞には、オーファントランスポーターであるSLC35F1、F2、F5およびF6の発現が認められた。このうちF1、F2は細胞膜に、F6はミトコンドリアへの局在が認められた。各トランスポーター遺伝子に対するレンチウィルスを調製し、それぞれ単独あるいは複数のウィスルを感染させた。puromycin耐性細胞における各トランスポーター遺伝子の発現を、real-time PCR法により確認した。耐性細胞であっても、対象遺伝子の発現低下が認められない場合もあり、また遺伝子によってノックアウト効率が大きく異なった。SLC35F1、F2に対しては顕著な低下が認められ、かつ同時にノックアウトすることに成功したが、同じ細胞でF5およびF6に対してはほとんど抑制効果が認められなかった。これらのトランスポターに対してはGuide RNAのデザインの見直しが必要である。F1およびF2をノックアウトした細胞は順調に増えており、リダンダントなシステムにより機能が補完されている可能性もある。
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