2015 Fiscal Year Research-status Report
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15K15013
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
篠原 美都 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (10372591)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 精巣 / 生殖 / Leydig細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
① Leydig幹細胞の濃縮と回収系の確立：一般にATP-binding cassette (ABC) transporterによるHoechst 色素の排出能に基づきフローサイトメトリーにて解析すると、幹細胞集団がside population (SP)分画に濃縮される。精巣のLeydig 幹細胞もこのSP分画に濃縮されるという報告があり、本研究ではSP分画をソーティングにて採取し、細胞培養に用いた。生後６－８週齢のROSA26 マウス（全身にてβ-galactosidaseを発現）、Green マウス（全身にてEGFP発現；大阪大学・岡部勝博士より供与）の精巣、またはこれらのマウスから実験的に作成した停留睾丸（cryptorchid: haploidの生殖細胞がないため、よりLeydig細胞が濃縮されている）を用いた。精巣細胞をcollagenaseとDNaseにて採取し、 Hoechst 33342 にて染色を行い、セルソーターにてHoechst redとHoechst blue で展開し、色素取り込みの少ないSP分画を回収した。さらにABC transporterの阻害剤VerapamilにてSP分画が消失することも確認した。
② Leydig幹細胞の培養： 生後４－５週齢の精巣細胞や、①にて濃縮した細胞集団を様々な条件にて培養し、試験管内の増幅を目指した。DMEM, IMDM, DMEM/F12, αMEMなど各種の培地をベースに無血清培地を作成して試した。EGF, FGF2, PDGFなどのサイトカインのや、Tissue culture-coated plateまたは細胞外マトリクスとしてlamininもしくはcollagenにてコートしたプレートなどを試した。温度については37℃と精巣環境に近い32℃の両方を試した。Leydig 細胞マーカーPDGFRA発現する細胞が２週間たっても維持されていた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
計画通りに進行している。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成２８年度の実験では、２７年度の実験で濃縮したLeydig細胞集団と、その培養細胞について遺伝子発現や移植による機能アッセイにより調べ、Leydig 細胞としての形質が維持されているかを観察する。
１）Leydig細胞マーカーの染色：Leydig培養細胞をサイトスピンにより一部標本にし、 ステロイド産生に関わるcytochrome P450 side chain cleavage (P450scc)や、PDGF受容体などLeydig細胞のマーカーの発現の有無を免疫染色にて調べ、Leydig細胞の形質を維持しているか確認する。
２）Leydig細胞の移植：培養細胞がLeydig幹細胞であるか否かは、その機能により定義される。従って、移植により長期間にわたって自己複製を維持するか調べる必要がある。野生型マウスやc-Kit分子欠損により先天的に内因性の精子形成が欠損したWマウスの精巣の間質に、Leydig培養細胞（ROSA26マウス由来、もしくはGreen マウス由来）をmicropipette を用いて注入する。移植後２－３ヶ月でホスト精巣摘出し、LacZ 染色もしくはUV照射にてドナー細胞由来のコロニー形成が間質に認められるか調べる。また免疫組織染色によりLeydig 細胞マーカーPDGFRA発現の有無を調べるとともに、Ki67抗原の発現を観察し、増殖活性を判定する。またドナー細胞のステロイド産生能を調べるため、抗P450scc抗体にて免疫染色を行う。
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| Causes of Carryover |
Leydig細胞の培養には市販の高価な無血清培地を使用する予定であったが、最近独自に開発した安価な無血清培地で代用できるようになったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
Leydig細胞の機能的アッセイとして、移植が最も信頼性が高いと思われるため、移植実験の量を増やす予定であり、未使用分は平成２８年度にその経費に充てる。
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