2016 Fiscal Year Research-status Report
乳腺幹細胞への高効率なダイレクトリプログラミング因子の同定
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15K15022
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| Research Institution | Waseda University |
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Principal Investigator |
仙波 憲太郎 早稲田大学, 理工学術院, 教授 (70206663)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 乳腺組織 / 脱分化 / リプログラミング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
a)スクリーニングに用いるレポーターマウスの乳腺上皮細胞(MEC)を不死化することに成功し、毎回primary培養することなく大量のドナー細胞を用意することができるようになり、スクリーニング作業が高効率に行えるようになった。
b)文献情報や各種データベースから任意に選別された脱分化誘導候補遺伝子115個から弱くレポーター発現を呈した2遺伝子は、その後のin vitroおよびin vivoの解析・検証から脱分化活性を有していないと判断された。また、前年度、幹細胞性レポーター細胞のレポーター蛋白質であるEGFPの陽性細胞と陰性細胞のRNAを回収し、NGS解析を行うことでEGFP陽性細胞に特異的に高発現すると思われる遺伝子候補を同定した。これが幹細胞性を正に付与、または幹細胞状態を維持させる活性を有する可能性が十分考えられたが、強制発現による幹細胞化活性が少なくともレポーター細胞で観察されなかった。
c)まだ試験的な段階であるが、ゲノム上の遺伝子をランダムにトラップさせてdoxycycline(dox)依存的に強制発現させる手法を開発した。このベクター系をレポーター細胞に導入して一方の幹細胞性レポーターであるpuromycin耐性によって選択を行ったところ、耐性を示し、かつもう一方のレポーターであるEGFPもdox依存的に陽性な独立クローンを4クローン得ることができた。このうち、dox非依存的なもう1クローンはレポーターをトラップしたものであった。これらの結果から今回開発した遺伝子トラップ技術はゲノム上の広い範囲の極めて多くの遺伝子から興味のある対象の遺伝子を簡便にスクリーニング可能であると考えられ、本脱分化因子のスクリーニングにおいても今後非常に有効なツールになると考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
MECを不死化できたことでこれまで著しい手間で律速であったMECの準備を短縮することができた。また、脱分化因子の同定には至っていないものの、遺伝子トラップ技術を開発することによってこれまでと比べ推定約2000倍の規模でしかも導入毎に異なるレパートリーのスクリーニングを行うことができるようになった。この技術を用いて目標（脱分化因子の同定）の達成を加速度的に遂行できるものと考えられる。さらには遺伝子が同定できていないものの、このトラップ技術を用いて実際レポーター細胞が陽性となるクローンが4つ得られている。これらから昨年度の3. やや遅れている、よりも、高く評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
上記の新規トラップ技術で高効率にスクリーニングできることが判明したため、乳腺幹細胞用により特化した型に改良し、効率を向上させた上で、さらに候補となる陽性クローンの単離を進めたい(目標100クローン)。ところが、こうして単離したクローンに多数挿入されたトラップベクターのうちどの遺伝子に作用してレポーターの発現を促進しているのかを同定する簡便な手法は現在存在しないため、原因遺伝子の同定が困難な状況となっている。そこで、これを解決する新たな手法の開発を早急に進める(このアイデアは既に固まっている)。また、昨年度見い出された乳腺幹細胞と思われるEGFP(+)の細胞が検出される頻度が、分画細胞の混合の違いによって差がみられるという知見を基に立てられた、乳腺上皮組織のある画分の細胞が別の画分の細胞の、おそらく自然に脱分化へ向かう能力を抑制しているという仮説を詳細に検証し、これに関わる抑制因子を同定することで、その機能阻害などから高効率な脱分化が可能となることが期待される。さらに、上記NGS解析はそれに用いたRNAの収量の問題があり、一部のリード数しか得られていない状況であった。しかし細胞の分画技術および微量RNAからのcDNA合成技術が改善されており、より精度の高い解析が可能となっている。問題は、高額なため予算が限られている点で実施できないことであるが、新たに大型研究費が得て展開させたい。
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| Causes of Carryover |
MECの不死化に成功したことで、マウスの購入費用や、primary cultureにかかる経費が大幅に削減された。また、遺伝子を生きた細胞からトラップさせる方法の開発に成功したことから、1つ1つ遺伝子をクローニングしたり、vectorを精製したりする必要が無くなり、それにかかる費用が大幅に削減された。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
上記の理由で研究費を節約できた反面、研究の推進方策で記載したように、遺伝子の同定を可能にする実験系の確立が必要となった。そこで、トラップ法から得られたクローンの中で原因遺伝子を同定するために必要なある酵素活性を創出するためのスクリーニング法の開発、およびその酵素の変異体作製のためのoligo DNAやランダム変異導入PCR kitの購入などにこの予算を使用したい。
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