2016 Fiscal Year Annual Research Report
Development of technical basis for direct observations of membrane protein complex in dynamic equilibrium under a physiological condition
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15K15035
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
相馬 義郎 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 准教授 (60268183)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 分子間相互作用 / 高速原子間力顕微鏡 / １分子直接観察 / 膜蛋白複合体 / 脂質２重膜 / ラフト / 抗原ー抗体反応 / アクアポリン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Ⅰ）細胞膜環境AFMプラットフォームの作成
本年は、AFMステージのマイカの物性による影響を最小限にとどめる目的で、直鎖PEGリン脂質誘導体含有脂質２重膜に水チャネルAQP4を組み込んで、膜蛋白の側方拡散の直接観察を行なったところ、PEGリン脂質誘導体の分布に偏りがある可能性が示唆された。そこで、次にナノディスクの適用を検討した。ナノディスクは潅流液組成等の条件を変えることにより、AFMステージ上を側方移動するのが観察された。これは、ナノディスク下面とAFMステージ間に潅流液層が存在していることを示唆している。したがって、今後の方向性として、ナノディスクを中核とした細胞膜環境AFMプラットフォームの開発・熟成が考えられた。
Ⅱ）高速AFM観察データの解析理論の確立
初年度に行なった、AQP4と抗AQP4抗体の結合・解離の系をモデルとした膜蛋白複合体中の各膜蛋白の動態および相互作用の直接観察技術の開発に続き、本年度は、高速AFMで直接観察されたAQP4アレイに対する抗AQP4抗体の秒レベルの早い結合・解離現象および長時間抗体作用時における継続的かつ動的な結合状態と、ELISAを用いたAQP4安定発現CHO細胞に対する抗AQP抗体の巨視的な結合量測定データを整合的に理解するための理論の構築に挑んだ。 AQP4アレイに対する抗AQP4抗体の結合・解離についての3遷移状態動態モデルを作成し、コンピュータ・シミュレーションを行なった。その結果、高速AFMで得られた一分子レベルでの抗体の結合・解離動態パラメータとELISAで得られた巨視的な抗体の結合・解離動態パラメータを単純な3遷移状態動態モデル上で整合させるのは困難であることがわかった。このことより、次のステップとして、一分子レベルと巨視レベルとの間のメゾスコピックな領域での直接観察・研究の重要性が明らかになった。
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