Analysis of secretory pathway of 14-3-3sigma

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15K15090
• Research Institution: Tokyo Medical University
• Principal Investigator: 松岡 正明 東京医科大学, 医学部, 主任教授 (70222297)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 14-3-3 / 分泌経路

Outline of Annual Research Achievements

14-3-3sigmaあるいはepsilon あるいは gammaの分泌のアッセイ系として、前年度に問題の生じたtransient transfecstionによるモデル系のかわりに、同タンパク質を恒常的に高発現するF11細胞のstable transformantを作製した。

まず、これら分子の分泌経路がconventional pathwayでないことを確認するため、Brefendinを作用させたところまったく抑制できなかった。従って14-3-3タンパク質の分泌経路はunconventional secretion pathway がメインの経路であると結論した。次に、14-3-3sigmaのC末にNanolucタグをfusionさせ、細胞外に分泌された14-3-3sigma-nanolucの量を測定する系を作製して、unconventional secretion pathwayのひとつであるCUPSを構成するGRASP１およびGRASP2をHela細胞、HEK293細胞に高発現させ、14-3-3sigmaの分泌にいかなる変化が生じるか検討した。その結果、一定した結果が得られず、結論がでなかった。また、逆に内在性のGRASP１およびGRASP2の発現をsiRNAによりノックダウンし、引き起こされる変化をHela細胞、HEK293細胞、U2OS細胞で観察したところ、やはり細胞によって引き起こされる変化は一定していなかった。分泌アッセイに関して、高発現実験やsiRNAを用いたloss-of-functionの試験は細胞によって出る影響が異なる可能性が高い。今後更なる検討を加え、最適のアッセイ系を構築して、更なる検討を行う。