液状化検体細胞診（LBC）検体を用いた子宮頸癌関連遺伝子異常の解析

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K15101
• Research Institution: Tokyo University of Technology
• Principal Investigator: 吉田 祥子 東京工科大学, 医療保健学部, 准教授 (20359681)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 池上 雅博 東京慈恵会医科大学, 医学部, 教授 (10151276) ; 沢辺 元司 東京医科歯科大学, 大学院保健衛生学研究科, 教授 (30196331)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 細胞診 / リアルタイムPCR / 遺伝子増幅

Outline of Annual Research Achievements

主にFISH 法を用いた研究により子宮頸癌における遺伝子増幅が報告されている8種類の遺伝子（c-mycほか）について、その増幅を特異的に検出できるようデザインしたプライマーを用いたリアルタイムPCR｛インターカレーター（SYBR Green）法｝により遺伝子増幅を検出できるか、検査法としての可能性の検討を行っている。今年度は、HeLa培養細胞や正常人末梢血を混じたLBC固定液（SurePath保存液）を模擬サンプル群とし、DNAの抽出方法を検討することからはじめた。検討の結果、DNAの抽出には、QIAamp MinElute Media Kit（QIAGEN）を用いることとした。さらに、リアルタイムPCRの反応条件の検討（PCR反応液に加えるテンプレート量の調整から融解曲線の確認まで）を行った。なお、増幅産物が目的遺伝子の塩基配列であることは、シーケンス解析により別途確認した。リアルタイム試薬については、Fast SYBRR Green Master Mix（ABI）および SYBRR Premix Ex Taq II（TaKaRa）を用いて比較を行った。TaKaRa社製は検体が微量である場合の増幅性に優れるものの、今回の研究においては安定した増幅結果を得ることができるABI社製のリアルタイム試薬にて進めることとした。HeLa培養細胞において遺伝子増幅や欠失が報告されている遺伝子について、リアルタイムPCRによりその増幅や欠失を数値的に再現することができた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

DNA抽出方法やリアルタイムPCRの反応条件の検討に考えていた以上の時間を要したため。

Strategy for Future Research Activity

研究対象として、倫理委員会の承認を得て病院の婦人科検診において採取されたLBC（約100 例）の余剰検体からDNAを抽出し、これを用いる。研究期間内に特に明らかにしたい以下の2 点、
・LBC 検体を用いて子宮頸部の癌化に関与する遺伝子の増幅を網羅的に検出すること
・相対的定量法による遺伝子増幅の客観的な検出方法が細胞診スクリーニングの補助的検査法となる可能性を探ることを到達目標として、検索を進める。

Causes of Carryover

DNA抽出方法等の検討に時間を要したため細胞診検体の提供を受けるまでに至らなかった。そのため次年度使用額が生じた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

未使用額を含め、主にDNA抽出キットやリアルタイムPCR試薬等の物品購入に使用する計画である。自身使用分を含め使用状況の確認を怠らずに行うこととする。