Fundamental Study on Preparations for Therapeutic Antibodies with Less Productions of Anti-Drug Antibodies

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15K15184
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 植田 正 九州大学, 薬学研究院, 教授 (90184928)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 日下部 宜宏 九州大学, 農学研究院, 教授 (30253595) ; 宗 孝紀 東北大学, 医学系研究科, 准教授 (60294964) ; 阿部 義人 九州大学, 薬学研究院, 准教授 (60315091) ; 白石 充典 九州大学, 薬学研究院, 助教 (00380527)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: Fab / 安定化

Outline of Annual Research Achievements

平成27年度に引き続きFab定常部に焦点を絞り安定性の向上を行った。昆虫学が専門である研究分担者の協力の下、当研究室で実施したX線結晶解析結果に基づき、13種のヒト型Fabの変異体をデザインし、カイコを用いて発現、精製した。PCR装置を用いた熱シフトアッセイ法により、それぞれの変異体Fabの安定性を評価したがいずれも野生型より不安定であった。
共同研究者により供与された、ヒト型FabのC末シスチン欠損体（ΔSSFab）を土台として、定常部に新規ジスルフィド結合を導入した変異体（ΔSSFabCL）はpH6.5において、ΔSSFabより5℃熱安定性が高い。免疫学が専門である研究分担者はこれらの２つの生理食塩水に溶解したFabを５匹のマウスに免疫した。17日後、38日後のそれぞれの抗原に対する抗体価をELISAにより評価した。その結果有意な差は認められなかった。
ヒト型Fabのモデル蛋白質として、マウス型FabのL鎖定常部のGlu123をCysに、Thr180をCysに変異した２種のL鎖変異体を調製し、H鎖と試験管内でFujiiらの報告（J.Biochem.2007）に従い再生した。精製後、二価性架橋試薬であるN-(4マレイミドブチリロイル)スクシニミドとpH５で反応させた後、試薬を除き、蛋白質溶液をpH8まで上げた。その後イオン交換樹脂で精製した。生成物を還元、非還元でSDS-PAGEを行ったところ、分子間架橋が形成していることがわかった。示差走査熱量計を用いて熱安定性を比較したところ、分子間架橋によりいずれの変異体も安定性が約10℃向上していた。L鎖のGlu123、Thr180のCysへの変異が、不安定化を引き起こしていたため、分子内架橋体は野生型より１～２℃しか安定化しなかったが、Fabの定常部位の分子間架橋が格段の安定化を引き起こす実験報告はなく、本架橋法はFabに広く応用できる架橋法となると期待される。