疾患特異的に糖鎖修飾異常を受けた蛋白質に対する自己抗体の新たな検出法

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K15200
• Research Institution: St. Marianna University School of Medicine
• Principal Investigator: 佐藤 利行 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 助教 (10350430)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 自己抗体 / 自己免疫疾患 / 蛋白質同定 / 糖鎖修飾

Outline of Annual Research Achievements

自己免疫疾患の特徴は疾患特異的な自己抗体の存在である。自己抗体の産生機序の一つとして、対応抗原である蛋白質が疾患特異的な翻訳後修飾をうけることが提唱されている。本研究では翻訳後修飾の中でも糖鎖修飾を標的とした。多くの癌種でムチン1の糖鎖異常があるなど疾患と関連する報告があり、様々な疾患で治療標的となりうる糖鎖異常が同定されると予想されるが、疾患特異的糖鎖異常を受けた蛋白質の同定はまだ十分とは言えない。以上の背景から、本研究の目的は、疾患特異的な糖鎖修飾変化を受けた蛋白質に対して産生された自己抗体の汎用的な検出法の確立とし、本年度は、疾患特異的な蛋白質糖鎖修飾異常を簡便に検出可能とするスクリーニング系の構築を試みた。
健常者の末梢血単核球（PBMCと略）の細胞質蛋白質を12.5%のポリアクリルアミドゲル電気泳動で展開させ、そのゲルをPVDF膜に転写した。蛋白質が転写されたPVDF膜を50 mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.5）中に浸し、そこに酵素濃度を変化させたPNGase F (Peptide-N-Glycosidase F)を加え、37℃で24時間の反応を行った。反応終了後、反応を行ったPVDF膜に対し、N型糖鎖中のマンノースを認識するConAを用いたレクチンブロットを行った。その結果、PVDF膜上で高分子側でのPBMC細胞質蛋白質の脱糖鎖が確認された。細胞質蛋白質の中に糖鎖が修飾される蛋白質が複数存在することを明らかにした。逆に、PVDF膜上で低分子側の蛋白質ではほぼ脱糖鎖が確認されなかった。酵素濃度や反応時間などの条件を検討したが、蛋白質を転写したPVDF膜上での効率の良い脱糖鎖を可能とする系を構築するには至らなかった。そこで、その代案として、蛋白質の脱糖鎖は液相での反応で行うものとして、脱糖鎖後の蛋白質に対して、自己免疫疾患患者血清および健常者血清を反応させることで、疾患特異的糖鎖異常蛋白質を新たに同定する。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

蛋白質を展開させたPVDF膜上で、PNGaseFにより効率よく脱糖鎖をさせる反応系は構築には至らなかったが、PNGaseFを用いて、脱糖鎖されたPBMCの細胞質蛋白質サンプルを作製することに成功している。今後は、得られた蛋白質サンプルを用いて、自己抗原となる蛋白質の同定を行っていく。

Strategy for Future Research Activity

今後は、液相反応により脱糖鎖されたPBMCの細胞質蛋白質サンプルを抗原として、新たな自己抗原となる、疾患特異的糖鎖異常を受けた蛋白質の同定へと進めていく。また、自己抗原の同定に至らない場合、脱糖鎖に用いる糖加水分解酵素を変更するなどして、スクリーニング系の修正をしていく。

Causes of Carryover

2015年度は糖蛋白質の同定およびその解析に着手ができなかったため、少々予算より支出が少なく残額が発生した。

Expenditure Plan for Carryover Budget

ほぼ申請書に沿って使用する予定であるが、達成度が遅れている新たな自己抗原となる糖蛋白質の同定に関する試薬などに大きく配分する予定である。また、研究計画最終年度であるため、学会発表にも使用する予定である。

Research Products

• [Journal Article] Disease Biomarker Analysis and Molecular Regulation Serum peptides as candidate biomarkers for dementia with Lewy bodies. (2015)
  • Author(s): Suzuki I., Noguchi M., Arito M., Sato T., Omoteyama K., Maedomari M., Hasegawa H., Suematsu N., Okamoto K., Kato T., Yamaguchi N., Kurokawa MS.
  • Journal Title: Int J Geriatr Psychiatry Volume: 30 Pages: 1195-206
  • DOI: doi: 10.1002/gps.4274.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Possible involvement of layilin in epitherial-mesenchymal transformation of renal tubular epithelia in glomerulonephritis. (2015)
  • Author(s): Adachi T., Arito M., Suematsu N., Kamijo-Ikemori A., Omoteyama K., Sato T., Okamoto K., Kimura K., Shibagaki Y., Kato T.
  • Journal Title: Biochem. Biophys. Res. Commun. Volume: 467 Pages: 63-9
  • DOI: doi: 10.1016/j.bbrc.2015.09.121.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Effects of methotrexate and salazosulfapyridine on protein profiles of exosomes derived from a human synovial sarcoma cell line of SW982. (2015)
  • Author(s): Tsuno H., Suematsu N., Sato T., Arito M., Matsui T., Iizuka N., Omoteyama K., Okamoto K., Tohma S., Kurokawa MS., and Kato T.
  • Journal Title: Proteomics Clin Appl. Volume: 10 Pages: 164-71
  • DOI: doi: 10.1002/prca.201500064.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Altered acetylation of proteins in patients with rheumatoid arthritis, revealed by acetyl-proteomics. (2015)
  • Author(s): Arito M., Nagai K., Ooka S., Sato T., Takakuwa Y., Kurokawa MS., Sase T., Okamoto K., Suematsu N., Kato T.
  • Journal Title: Clin Exp Rheumatol Volume: 33 Pages: 877-86
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] NF-κB コリプレッサー（MTI-II）の作用部位を利用した短鎖ペプチド抗炎症薬のIn vivo試験 (2015)
  • Author(s): 岡本一起 、佐藤政秋、表山和樹、佐藤利行、有戸光美、黒川真奈絵、末松直也、遊道和雄、加藤智啓
  • Organizer: 第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会 合同大会
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド（兵庫県神戸市）
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [Presentation] 好中球Myeloperoxidaseの等電点をアルカリ側にシフトさせる酸化修飾の解析 (2015)
  • Author(s): 永井宏平、内田貞輔、浄弘由紀子、西野芽玖、佐藤利行、大岡正道、有戸光美、黒川真奈絵、加藤智啓
  • Organizer: 日本プロテオーム学会2015年会
  • Place of Presentation: くまもと森都心プラザ（熊本県熊本市）
  • Year and Date: 2015-07-23 – 2015-07-24
• [Presentation] レビー⼩体型認知症における血清ペプチドバイオマーカーの探索 (2015)
  • Author(s): 黒川真奈絵、有戸光美、佐藤利行、表山和樹、末松直也、岡本一起、加藤智啓
  • Organizer: 日本プロテオーム学会2015年会
  • Place of Presentation: くまもと森都心プラザ（熊本県熊本市）
  • Year and Date: 2015-07-23 – 2015-07-24
• [Presentation] シェドミクス法の確立に関する研究 (2015)
  • Author(s): 表山和樹、有戸光美、佐藤利行、岡本一起、末松直也、黒川真奈絵、加藤智啓
  • Organizer: 日本プロテオーム学会2015年会
  • Place of Presentation: くまもと森都心プラザ（熊本県熊本市）
  • Year and Date: 2015-07-23 – 2015-07-24
• [Presentation] 炎症性転写因子NF-κB のコリプレッサーMTI-IIを利用した抗炎症剤のin vivo 抗炎症効果と副作用 (2015)
  • Author(s): 岡本一起 、表山和樹、佐藤利行、有戸光美、黒川真奈絵、末松直也、遊道和雄、礒橋文秀、加藤智啓
  • Organizer: 日本ビタミン学会第67回大会
  • Place of Presentation: 奈良春日野国際フォーラム 甍～I・RA・KA～（奈良県奈良市）
  • Year and Date: 2015-06-05 – 2015-06-06
• [Presentation] Serum peptides as candidate biomarkers for dementia with Lewy bodies (2015)
  • Author(s): Kurokawa MS., Suzuki I., Noguchi M., Arito M., Sato T., Omoteyama K., Maedomari M., Hasegawa H., Suematsu N., Okamoto K., Yamaguchi N., Kato T.
  • Organizer: 第11回日本臨床プロテオーム研究会
  • Place of Presentation: 国際研究交流会館（東京都中央区）
  • Year and Date: 2015-05-23 – 2015-05-23
• [Presentation] サーフェスオミックスを利用したサラゾスルファピリジンの作用の解析 (2015)
  • Author(s): 表山和樹、佐藤利行、有戸光美、末松直也、黒川真奈絵、加藤智啓
  • Organizer: 第59回日本リウマチ学会総会・学術学会
  • Place of Presentation: 名古屋国際会議場（愛知県名古屋市）
  • Year and Date: 2015-04-23 – 2015-04-25
• [Presentation] ANCA関連血管炎における好中球ミエロペルオキシダーゼの酸化修飾 (2015)
  • Author(s): 内田貞輔、永井宏平、佐藤利行、大岡正道、有戸光美、尾崎承一、黒川真奈絵、加藤智啓
  • Organizer: 第59回日本リウマチ学会総会・学術学会
  • Place of Presentation: 名古屋国際会議場（愛知県名古屋市）
  • Year and Date: 2015-04-23 – 2015-04-25