妊娠期ヒ素曝露によるF2肝腫瘍増加機序解明のための精子の網羅的DNAメチル化解析

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K15246
• Research Institution: National Institute for Environmental Studies
• Principal Investigator: 野原 恵子 国立研究開発法人国立環境研究所, 環境健康研究センター, センター長 (50160271)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 秦 健一郎 国立研究開発法人国立成育医療研究センター, 周産期病態研究部, 部長 (60360335)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 継世代影響 / 妊娠期曝露 / 無機ヒ素 / DNAメチル化 / 精子 / 肝腫瘍

Outline of Annual Research Achievements

C3Hマウスは雄が高齢になると一定の割合で肝腫瘍を自然発症する系統である。C3Hマウスの妊娠8－18日の母親(F0)に無機ヒ素を投与することによって、F1雄を介してF2雄に肝腫瘍が増加することが明らかになっている。そこで本研究では、その原因がF1雄の精子のDNAメチル化変化によるとの仮説を設定し、Reduced representation bisulfite sequencing (RRBS)法によって妊娠期無機ヒ素曝露による子の精子のDNAメチル化変化を明らかにする計画である。
対照群雄5匹および妊娠期に無機ヒ素を投与した母親F0から生まれたF1雄5匹の精巣上体尾部より精子を採取し、DNAを調製した。DNAを制限酵素で水解して断片化し、アダプター付加、精製後bisulfite 処理を行い、RRBSライブラリーを作製した。PCR法によりテンプレートライブラリーを増幅し、現在次世代シークエンスを実施している。
研究協力者：岡村和幸、鈴木武博（国立環境研究所）、中林一彦（国立成育医療研究センター）、松下隼也（東京理科大学、国立環境研究所）

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

合計10サンプルについて次世代シークエンスを行っている。各サンプルについて5 Gb以上の読み取りを予定しており、2.5-3.9 Gbの読み取りを終了した。追加の読み取りに関してトラブルが発生し、今年度中に目的の読み取りを終了することができなかった。

Strategy for Future Research Activity

今年度は次世代シークエンスを完了し、データ解析を行う。取得したデータについて、統計ソフトR上でmethylkitパッケージおよびedmrパッケージを用い、妊娠期ヒ素曝露によってF2でメチル化が変化したシトシン(DMC)および領域(DMR)を検出する。特に遺伝子発現の制御に重要と考えられる転写開始点±2000 bpの領域等をLinux上でbed tools closestを用いて検出し、解析を進める。
上記の解析で得られた結果について、qMSPやPyrosequence 等の方法でvalidation を行い、妊娠期ヒ素曝露によってF1精子で影響を受けるDNAメチル化領域を明らかにする。
本研究によって、妊娠期ヒ素曝露によるF2肝腫瘍増加メカニズムの解析を進めるための重要な知見を得ることができる。

Causes of Carryover

次年度において次世代シークエンスの読み取り追加を行い、バイオインフォマティクス解析やvalidationを行う。このために試薬購入費や人件費等を使用する。また成果発表の費用が必要である。

Expenditure Plan for Carryover Budget

各種試薬代、人件費、成果発表のための費用。