感受性非依存的にアルコール摂取行動を調節する新規Ｓｒｃ改変マウスモデルペアの解析

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K15261
• Research Institution: University of Yamanashi
• Principal Investigator: 加藤 梧郎 山梨大学, 総合研究部, 助教 (60177441)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: エタノール / Src / ユニークドメイン / タンパク質リン酸化

Outline of Annual Research Achievements

Srcのセリン75リン酸化の阻害変異(SA)及び、擬似変異(SD)を導入した遺伝子改変マウスの未知の嗜好性調節の分子機序を明らかにするため、今年度は以下の研究を行った。
１、セリン75リン酸化酵素Cdk5の活性化サブユニットp35欠損とSrcセリン75変異の二重変異マウス株の樹立：p35欠損マウスの飼育維持とPCR法による遺伝子型同定システムを構築した。p35（+/-）マウスを繁殖後、p35（+/-）・Src(WT/SA)のダブルヘテロ接合体変異マウスを得るため、SA変異ホモ接合体マウスと交配させ順調に仔マウスを得ている。
２、Two-bottle選択試験によるエタノール摂取及び嗜好性制御の特性の評価：SD変異とSA変異のエタノール摂取及び嗜好性制御の濃度依存性を確認するため、5%及び10%エタノールによるTwo-bottle選択試験を実施した。検体数がまだ少ないが両変異マウスの嗜好性の濃度依存性が明らかになると期待される。
３、脳内NMDAR（グルタミン酸受容体）各サブユニットのリン酸化の変動解析と活性化型（active）Srcレベルの解析：前脳や海馬等の脳内各領域の採取法を検討し、NR2Aリン酸化部位Y1325、S1232、またNR2Bリン酸化部位Y1472のリン酸化レベルの変動を明らかにするため、ホモジネートを調製後、Zhang S らの方法に従い、細胞質画分とシナプトソーム膜画分を得た。可溶化後、各サブユニットに対する抗体及びリン酸化部位特異的抗体を用いた各リン酸化レベルの解析法をウエスタンブロットの実験条件を中心に検討し、確立した。また、active Srcレベル解析に関しては免疫沈降法の実験条件を検討し、解析法を確立した。
これらはSrc/Cdk5によるエタノール摂取行動の調節機構を解明に向けた重要な基盤の確立となる成果である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本研究の目的は、エタノール嗜好性調節の分子機序を明らかにするため、SD変異マウスとSA変異マウスを用いて新規のCdk5/Srcフィードバック調節ループ仮説を検証することである。そのため、本研究計画はp35欠損マウスとのダブル遺伝子改変マウスの作出を柱としている。しかし、動物実験承認手続きの遅れから、実験開始が昨年１２月以降になり予定より遅れている。エタノール濃度依存的嗜好性の試験は、現有設備の制約や一クルーに約１か月を要することなどを考慮するとほぼ期待通りの進捗である。NMDARの各サブユニットのリン酸化解析については、NR2AサブユニットのS1232のリン酸化の同定が成功していない。しかしその他の部位に関しては予定通りである。これらを総合してやや遅れているという評価にした。

Strategy for Future Research Activity

p35欠損マウスとのダブル遺伝子改変マウスの作出開始は予定より遅れたが、懸念されたp35欠損マウスの繁殖が幸い予想以上に順調であり、Srcの改変マウスとの交配においても仔の出産が順調に進みそうなので、ダブルヘテロ接合体変異マウスの樹立が当初計画より大幅に遅れることはないと考えれる。NR2AサブユニットのS1232のリン酸化については、リン酸化部位特異的抗体の性状に依るところが大きいと考えられる。従って予算の許す範囲でリン酸化ペプチド抗原の合成および特異抗体の取得・アフィニティカラムによる精製も検討したい。