2015 Fiscal Year Research-status Report

筋内CD8陽性T細胞のトランスクリプトーム解析による自己免疫学的炎症病態の解明

Research Project

Project/Area Number	15K15333
Research Institution	The University of Tokyo
Principal Investigator	作石かおり東京大学, 医学部附属病院, 助教 (70722685)
Project Period (FY)	2015-04-01 – 2018-03-31
Keywords	筋炎 / トランスクリプトーム解析 / 次世代シークエンサー / レーザーマイクロダイセクション / TCR解析 / RNA-seq / CD8陽性T細胞
Outline of Annual Research Achievements	近年、分子標的生物製剤が多発性硬化症や関節リウマチなどの自己免疫疾患で目覚ましい治療成果を挙げている一方で、特発性炎症性筋疾患ではまだ応用されるに至っていない。本研究は、超微量サンプルでも可能となってきた最新のトランスクリプトーム解析技術を用いて、細胞免疫学的な病態が解明されていない特発性炎症性筋疾患における筋局所の免疫担当細胞について詳細な細胞免疫学的検討を行い、炎症機転を規定する効果的な治療ターゲットを発見することを目標としている．具体的には、急性に進行する多発筋炎と慢性に経過する封入体筋炎の2つの特発性炎症性筋疾患に注目し、各々の疾患におけるCD8陽性T細胞の機能特性を明らかにするため、laser microdissectionで筋内CD8細胞を切り出し、次世代シークエンサーを用いてT細胞レセプター解析を進めている．本手法によって、抗原刺激を介して筋内で増殖活性化しているCD8陽性細胞の同定を試みる．同定されたCD8細胞は筋内で炎症の主要な担い手であると考えられ、これに特化した網羅的な機能解析を行い、当施設の筋生検バンクにある多発筋炎と封入体筋炎の組織間で比較することで、急性と慢性の炎症機転を規定するT細胞関連分子を解明し、治療ターゲットになる可能性を検討していく．
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 本研究の第一段階として、筋組織を蛍光標識された抗PE-CD8抗体で染色し、CD8陽性細胞をLMDにて300個以上切り取り、RNAを抽出することは成功した．しかし、当初の予想通り、NGSを用いたTCR遺伝子の配列解析を行うために必要な良質なRNAを十分量（10～30ng）得ることに苦慮している．一方、末梢単核球から抽出したRNAを用いたTCR遺伝子解析の検討は進んでいる．当初目標にしていたTCRβ鎖のみならずα鎖についても、PCRで増幅し、配列をIllumina MiSeqを用いて解析することが可能となった． Illumina Hiseq2500を用いたRNA sequencingについてはさらにサンプル量を要することとなるため、現在single cellレベルでの解析に移行することを検討中である．
Strategy for Future Research Activity	筋内CD8細胞からのRNAの抽出に関しては、引き続き組織固定並びに染色過程でのRNAの劣化をいかに抑えて行くのか検討を重ねていく．TCRレパトア解析に関しては、限界下限のサンプル量での解析を行った際に、頻度に関する定量的信頼性がいかに担保されるのか検討していくことが今後の課題である．まずは健常者の末梢血単核球（PBMC）中のT細胞をFACSでsortingし、サンプルの細胞数のtiterationを行い、得られた結果の安定性を確認していく．当初の計画では、2年目以降は、TCRレパトア解析結果を基にclonal expansionを起こしていると考えられるCD8細胞に注目し、RNA-Seqを行うことを予定していたが、その前段階の検討に時間を要している状況にある．しかし、今後の本研究を推進するにあたり、十分な検討は必要不可欠であり、見通しとしては次年度中には乗り越えることが可能と考えている． 2年目の目標として、筋内CD8陽性細胞のTCRレパトア解析結果を得ることと、RNAseqに関してはハードルを下げまずは筋炎患者のPBMCのT細胞の解析を行っていくことを掲げる．3年目には筋内CD8陽性細胞のTCRレパトア解析結果を学会で発表することを視野に入れる．
Causes of Carryover	予定していた試薬・物品類（核酸抽出カラムキット、蛍光染色抗体、PCR試薬、シークエンシング試薬）については、本年使用分は、既存のもので大部分がまかなわれたため、追加購入する物品類はLMD用の特殊スライドなどに限られた．LMDの使用料についても当初推定していた金額より低く抑えることが出来た．当初TCRシークエンシング試薬として特殊なキットを購入する予定であったが、進捗状況が遅れているため、来年度に購入することになった．
Expenditure Plan for Carryover Budget	次年度は、TCRシークエンシングを頻回に繰り返すことが予想され、さらに末梢血単核球を用いてRNA-seqの予備検討を行う方針でもあるため、シークエンシング試薬を多く購入する予定である．また、FACS sortingも予定しており、抗体購入費も加わり、使用額が初年度よりも極端に増えることが想定される。