筋内CD8陽性T細胞のトランスクリプトーム解析による自己免疫学的炎症病態の解明

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K15333
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 作石 かおり 東京大学, 医学部附属病院, 助教 (70722685)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 筋炎 / トランスクリプトーム解析 / 次世代シークエンサー / レーザーマイクロダイセクション / TCR解析 / RNA-seq / CD8陽性T細胞

Outline of Annual Research Achievements

近年、分子標的生物製剤が多発性硬化症や関節リウマチなどの自己免疫疾患で目覚ましい治療成果を挙げている一方で、特発性炎症性筋疾患ではまだ応用されるに至っていない。筋炎において細胞免疫学的な病態解明が進んでいないことが背景の一つに挙げられる。本研究では、いずれも筋内にCD8陽性Tリンパ球（CD8細胞）主体の細胞浸潤を認めるものの、急性に進行する多発性筋炎と慢性に経過する封入体筋炎の2疾患に注目し、laser microdissectionにて筋内CD8細胞を切り出し、次世代シークエンサーを駆使して、各々の疾患におけるCD8細胞の機能特性を明らかにする。本研究の特色は、超微量サンプルでも可能となってきた最新のトランスクリプトーム解析技術を用いて、従来ヒトでは困難であった臓器局所のリンパ球サブセット単位の詳細な細胞免疫学的検討を行い、炎症機転を規定する効果的な治療ターゲットを発見しようとするところにある。合わせて、他のリンパ球サブセットの異常の有無についても特徴的な変化がないか検討していく。また、末梢血リンパ球と炎症局所のリンパ球との相違についても検討を重ね、臓器特異的な変化についての考察も行っていく。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

LMDを用いて筋組織から蛍光標識にてCD8陽性細胞を切り出すことは可能になったがNGSを用いたTCR遺伝子解析を行うための良質なRNAを得ることに難渋している。このため本年度より末梢血単核球（PBMC）よりFACSにてCD8陽性細胞をソーティングしてTCR遺伝子解析を進めている。十分量の細胞数が得られる状況でTCR遺伝子の解析はIllumina Miseqを用いて解析できることを確認することはできた。次のステップとしてsingle cellレベルでの解析の調整を行っており、これに時間を要している。

Strategy for Future Research Activity

現在健常者のPBMCのTCR解析は安定して行えるようになっているので、今後は筋炎患者由来の発症時のPBMCのTCR遺伝子解析を進めていく。合わせて、固定後の筋病理サンプルからLMDを用いて切り出し微量レベルのRNAよりRNA-Seqを行っていく手法を引き続き検討するとともに、LMDによる切り出しにこだわらず、筋生検で得られた新鮮な筋組織より直接FACSにてCD8細胞をソーティングする手法もチャレンジして、筋内CD8陽性細胞のTCRレパトア解析とRNAseqという当初の目標を達成できないか検討する。

Causes of Carryover

本年も引き続き予定していた試薬・物品類（核酸抽出カラムキット、蛍光染色抗体、PCR試薬、シークエンシング試薬、LMD特殊スライド）については既存のものでまかなわれたため、予定していた金額よりも低く抑えられている。FACSソーティングなどについても、コア施設を利用しているが、院内であるため使用料が発生していない。

Expenditure Plan for Carryover Budget

次年度は、シングルセルのシークエンシングを行う方針であるが、当施設では試薬が存在しないため、現在購入手配を進めている。また、FACS様の抗体のストックが無くなってきたため新たに購入を予定している。