遺伝子改変インスリン分泌細胞株の効率的作製法開発とインスリン分泌機構解明への応用

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K15351
• Research Institution: Nihon University
• Principal Investigator: 石原 寿光 日本大学, 医学部, 教授 (60361086)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: インスリン分泌 / β細胞 / 遺伝子操作

Outline of Annual Research Achievements

膵β細胞からのインスリン分泌機構の詳細を理解するために、インスリン分泌細胞株であるMIN6細胞に遺伝子導入し、安定細胞株を作成する方法を検討している。
平成27年度には、RMCE法による遺伝子導入を可能とし、遺伝子過剰発現インスリン分泌細胞株をラージスケールで作成することを可能とする方法の第一段階を確立した。最終的に遺伝子の挿入部位を決定することができた。これまでに知られた遺伝子であり、β細胞での発現が豊富である遺伝子であった。また、この遺伝子のノックアウトで問題が生じることがないことが報告されているので、我々の作成したシステムでは、安全な場所への挿入が可能となっていると結論できた。
平行して、20 mMのグルコースによるインスリン分泌応答が5 mMグルコース時の8～11倍になるインスリン分泌の良いクローン3つと2～5倍であるインスリン分泌の低下した3つのクローンの転写産物をDNA mcroarrayで比較検討した。分泌の良い3つのクローンに共通して発現が増加し、分泌の悪いクローンで共通して発現が低下している遺伝子、あるいはこの逆の関係になっている遺伝子を抽出したところ、約1,000個が存在した。これらの中で、すでに遺伝子名が付与されている遺伝子は約650であった。これらの中には、約30個のこれまでにインスリン分泌に重要な役割を果たすことが知られている遺伝子が抽出されてきており、この方法が適切なものであることを示していた。
このうち、ｃDNA長が2500bp以下で、他のmicroarrey　解析で、実際のβ細胞で発現が認められているものを中心に100個を選択し、現在74個について、遺伝子過剰発現がインスリン分泌に与える効果を検討し終えた。 その結果、約10個のインスリン分泌に重要な役割を果たすと考えられる新規遺伝子を同定することができた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

RMCE法による遺伝子導入を可能とし、遺伝子過剰発現インスリン分泌細胞株をラージスケールで作成することを可能とする方法の第一段階を確立した。また、100個近い遺伝子の過剰発現細胞を作成することで、新規のインスリン分泌に重要な遺伝子の同定ができた点は、順調な進捗といえる。ただし、遺伝子発現を抑制する方法の確立において、shRNAを発現する系は、確立しつつあるものの、CRISPRを利用する系が、CRISPRの遺伝子が大きく、扱いに手間どっており、遅れが生じている。

Strategy for Future Research Activity

MIN6細胞において、遺伝子発現を抑制する方法を確立することをまず第一に行う。これによって、本日までに同定されたインスリン分泌に重要な新規遺伝子をさらに検証することができる。同時に、過剰発現がインスリン分泌に変化を与える遺伝子については、細胞内代謝の流れ等を解析中であるが、さらにこれを推し進めていく。
また、インスリン分泌の良いクローンと低下しているクローンの間で、発現が異なる遺伝子の中には約100個のlncRNAが存在していた。これらについても、過剰発現あるいは発現抑制を行って、インスリン分泌への効果を解析する予定である。

Research Products

• [Journal Article] Is zinc an intraislet regulator of glucagon secretion? (2016)
  • Author(s): Ishihara H, Wollheim CB.
  • Journal Title: Diabet Int. Volume: 7 Pages: 106-110
  • DOI: doi:10.1007/s13340-016-0259-x
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] High-fat diet feeding significantly attenuates anagliptin-induced regeneration of islets of Langerhans in streptozotocin-induced diabetic mice (2015)
  • Author(s): Ｓhinjo T, Nakatsu Y, Iwashita M, Sano T, Sakoda H, Ishihara H, Kushiyama A, Fujishiro M, Nishimura F, Asano T.
  • Journal Title: Diabetol Metab Syndr Volume: ７ Pages: 50
  • DOI: doi: 10.1186/s13098-015-0047-y.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] DPP-IV inhibitor anagliptin exerts anti-inflammatory effects on macrophages, adipocytes, and mouse livers by suppressing NF-κB activation. (2015)
  • Author(s): Ｓhinjo T, Nakatsu Y, Iwashita M, Sano T, Sakoda H, Ishihara H, Kushiyama A, Fujishiro M, Fukushima T, Tsuchiya Y, Kamata H, Nishimura F, Asano T.
  • Journal Title: Am J Physiol Endocrinol Metab. Volume: 309 Pages: E214-E223
  • DOI: doi: 10.1152/ajpendo.00553.2014.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Octreotide for hypoglycemia caused by sulfonylurea and DPP-4 inhibitor. (2015)
  • Author(s): Yamaguchi, S., Ikejima, M., Furukawa, A., Abe, M., Nakazaki, M., Ishihara, H.
  • Journal Title: Diabetes Res Clin Pract. Volume: 109 Pages: e8-e10
  • DOI: doi: 10.1016/j.diabres.2015.05.008.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Inhibition ameliorates pancreatic β-cell failure and improves glucose tolerance in the mouse model of Wolfram syndrome (2015)
  • Author(s): Tanji Y, Yamaguchi S, Ishigaki Y, Katagiri H, Oka Y, Ishihara H.
  • Journal Title: J Diabet Mellitus Volume: 5 Pages: 72-80
  • DOI: doi: 10.4236/jdm.2015.52009.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Establishment of efficient gene transfer system based on RMCE method in MIN6 cells, and new findings of novel genes involved in insulin secretion (2016)
  • Author(s): Yamaguchi S, Ishihara H
  • Organizer: 第59回日本糖尿病学会年次学術集会
  • Place of Presentation: 京都国際会議場 ロームシアター みやこめっせ （京都府・京都市）
  • Year and Date: 2016-05-19 – 2016-05-22
  • Invited
• [Presentation] Screening by RMCE-mediated generation of MIN6 cell transformants identifies novel genes important for insulin secretion (2015)
  • Author(s): Furukawa A, Tanaka A, Kosuda M, Otsuka Y, Yamaguchi S, Ishihara H.
  • Organizer: Keystone Symposia Diabetes： New insights into molecular mechanisms and therapeutic strategies.
  • Place of Presentation: ウェスティン都ホテル京都 （京都府・京都市）
  • Year and Date: 2015-10-25 – 2015-10-29
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Screening by RMCE-mediated generation of MIN6 cell transformants identifies novel genes important for insulin secretion (2015)
  • Author(s): Ishihara H, Yamaguchi S
  • Organizer: 第58回日本糖尿病学会年次学術集会
  • Place of Presentation: 海峡メッセ下関 他 （山口県・下関市）
  • Year and Date: 2015-05-21 – 2015-05-24
  • Invited