ダウン症のTAMにおける白血病発症高リスク群の画期的同定法の開発

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K15384
• Research Institution: Hirosaki University
• Principal Investigator: 伊藤 悦朗 弘前大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (20168339)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 土岐 力 弘前大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (50195731) ; 照井 君典 弘前大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (00333740)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 小児白血病 / GATA1 / MRD / TAM / ダウン症 / 急性巨核芽球性白血病

Outline of Annual Research Achievements

ダウン症は白血病のリスクが高く、5～10％の新生児はTAMと呼ばれる前白血病を発症し、その20％は生後４歳までに真の白血病（DS-AMKL）へ進展する。最近我々は、GATA1変異を持つTAM細胞にコヒーシン複合体／CTCF、EZH2などをコードする遺伝子群に高頻度に変異が生じていることを発見した。
前白血病の段階であるTAMクローンを根絶することができれば、DS-AMKLの発症を予防できると考えられる。本研究の目的は、DS-AMKLに進展するTAM患者を正確に同定する画期的な方法を開発し、白血病予防法を開発するための基礎を築くことである。本年度は、以下の２点の目的に焦点を絞って研究を行った。
1. GATA1 変異を用いた微小残存病変の検出：寛解後の患者末梢血よりゲノム DNAを抽出し、それを鋳型に GATA1 遺伝子 の一部を増幅する。増幅産物のうち第二エクソン部分を、次世代シーケンサーを用いて100,000以上のカバレッジで検索し 0.02%の感度で変異の検出する方法を開発した。
2. コヒーシンなどのDS-AMKL関連遺伝子変異の検出： AMKLを発症する症例では、既にTAM診断時検体にGATA1以外のDS-AMKL特異的遺伝子変異を有するマイナークローンが存在する可能性がある。本年度は、TAM寛解後にDS-AMKLを発症した１０症例のAMKL細胞を用いて、DS-AMKL 関連遺伝子のターゲットシーケンスを行った。また、TAMからDS-AMKLに進展した1症例の全ゲノムシーケンスを行い、CTCFの欠失部位の塩基配列を確定した。その情報をもとに、TAM発症時の微少残存腫瘍の存在をDroplet Digital PCR法で解析した。その結果、TAMでは、CTCF欠損を有するDS-AMKLクローンは検出感度以下であることが明らかとなった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究の目的は、DS-AMKLに進展するTAMの患者を正確に同定する画期的な方法を開発し、白血病予防法を開発するための基礎を築くことである。
本年度は、以下の研究成果が得られ、概ね順調に研究が進展している。
GATA1 変異を用いた微少残存病変（GATA1-MRD）検出法を開発した。TAMでみられるGATA1変異は、多様性に富み、芽球の割合も非常に幅があることから、変異特異的 PCRなどでは検出や定量が困難である。そこで、次世代シーケンサーを用いた、アンプリコンシーケンスによって、変異の同定を試みた。7.2kbと1.5kbの増幅産物をNexteraシステム（トランスポゾン）で300 bpほどの長さにランダムに断片化し、次世代シーケンサーで解析した。診断時の変異検索の際には、coverageを20,000として、0.3%の頻度の変異を検出可能であった。次に MRDの検出に用いることができるか、さらに感度を上げて検索をした。Coverageを100,000とすると既知の変異であれば0.02%の感度で変異を検出することが可能となった。
AMKLを発症する症例では、既に、TAM診断時検体にGATA1変異以外のDS-AMKL特異的遺伝子変異を有するマイナークローンが存在する可能性がある。本年度は、TAM寛解後にDS-AMKLを発症した１０症例のAMKL細胞を用いて、DS-AMKL 関連遺伝子のターゲットシーケンスを行った。また、TAMからDS-AMKLに進展した1症例の全ゲノムシーケンスを行い、CTCFの欠失部位の塩基配列を確定した。その情報をもとに、TAM期のMRDをDroplet Digital PCR法で解析した。その結果、TAMでは、CTCF欠損を有するDS-AMKLクローンは極めて少なく検出感度以下であった。

Strategy for Future Research Activity

本研究の目的は、DS-AMKLに進展するTAMの患者を正確に同定する画期的な方法を開発し、白血病予防法を開発するための基礎を築くことである。
平成２７年度は、GATA1 変異を用いた微少残存病変（GATA1-MRD）検出法を開発した。Nexteraシステムを用いて 卓上型次世代シークエンサーMiSeqで解析し、0.02%の感度で変異を検出することが可能となった。本年度は、さらに高感度なエラーコレクテイド・シークエンス法を用いて、10-4～10-5の感度でMRDを検出できる方法を開発することを目指す。この方法を用いて、日本小児白血病リンパ腫研究グループ（JPLSG）のTAMの前方視的観察研究 （TAM-10）の検体を用いて、GATA1-MRDを解析する。TAM-10では、既に160名以上のTAM症例を蓄積し、診断後１ヶ月と３ヶ月の末梢血も保存されている。これらの症例の中から、約20％（約30例）がDS-AMKLを今後２年以内に発症すると推定される。
昨年度は、TAM寛解後にDS-AMKLを発症した１０症例のAMKL細胞を用いて、DS-AMKL 関連遺伝子のターゲットシーケンスを行った。本年度は、さらにエクソームシークエンスを行い、GATA1変異以外のDS-AMKL特異的遺伝子変異を同定する。その情報をもとに、TAMの時期にDS-AMKLマイナークローンが存在するかどうかをDroplet Digital PCR法やエラーコレクテイド・シークエンス法で解析する。
以上の解析から、GATA1-MRDやDS-AMKL 関連遺伝子の変異検出がDS-AMKLに進展するTAM症例を同定するのに有用かどうかを検証する。

Research Products

• [Journal Article] Preserved High Probability of Overall Survival with Significant Reduction of Chemotherapy for Myeloid Leukemia in Down Syndrome: A Nationwide Prospective Study in Japan. (2016)
  • Author(s): Taga T, Watanabe T, Tomizawa D, Kudo K, Kiminori Terui K, Moritake H, Kinoshita A, Iwamoto S, Nakayama H, Takahashi H, Shimada A MD, Taki T, Toki T, Ito E, Goto H, Koh K, Saito AM, Horibe K, Nakahata T, Tawa A, Adachi S.
  • Journal Title: Pediatr Blood Cancer Volume: 63 Pages: 248-54
  • DOI: 10.1002/pbc.25789
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Transient myeloproliferative disorder with partial trisomy 21. (2015)
  • Author(s): Takahashi T, Inoue A, Yoshimoto J, Kanamitsu K, Taki T, Imada M, Yamada M, Ninomiya S, Toki T, Terui K, Ito E, Shimada A
  • Journal Title: Pediatr Blood Cancer Volume: 62 Pages: 2021-4.
  • DOI: 10.1002/pbc.25624
  • Peer Reviewed
• [Presentation] DNA methylation state correlates with progression of myeloid leukemia in Down syndrome. (2015)
  • Author(s): Saida S, Nakamura M, Toki T, Arai Y, Terui K, Yoshida Y, Ogawa S, Nakahata T, Heike T, Watanabe K, Watanabe A, Ito E.
  • Organizer: 第57回アメリカ血液学会
  • Place of Presentation: オーランド（米国）
  • Year and Date: 2015-12-05 – 2015-12-08
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Prospective study of 168 infants with transient abnormal myelopoiesis with Down syndrome: Japan Pediatric Leukemia/Lymphoma Study Group, TAM-10 study (2015)
  • Author(s): Muramatsu H, Watanabe T, Hasegawa D, Park M, Iwamoto S, Taga T, Ito E, Toki T, Terui K, Yanagisawa R, Koh K, Saito A, Horibe K, Hayashi Y, Adachi S, Mizutani S, Watanabe K.
  • Organizer: 第57回アメリカ血液学会
  • Place of Presentation: オーランド（米国）
  • Year and Date: 2015-12-05 – 2015-12-08
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] TAMの最新情報（教育講演） (2015)
  • Author(s): 伊藤悦朗
  • Organizer: 第60回日本新生児生育医学会
  • Place of Presentation: いわて県民情報交流センター「アイーナ」，盛岡地域交流センター「マリオス」，ホテルメトロポリタン盛岡（岩手県盛岡市）
  • Year and Date: 2015-11-23 – 2015-11-25
  • Int'l Joint Research / Invited