Fluorescent detection of dystrophin mRNA with bispyrene labeled probe

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15K15395
• Research Institution: Kobe Gakuin University
• Principal Investigator: 松尾 雅文 神戸学院大学, 総合リハビリテーション学部, 教授 (10157266)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: エクソンスキッピング / ジストロフィン遺伝子 / スプライシング

Outline of Annual Research Achievements

デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療としてエクソンスキッピング誘導が最も有力なものとして注目されている。この方法では、ジストロフィン遺伝子内の７９ケのエクソンの中で、１１のエクソンがスキッピング誘導の有力な対象となる。これらのエクソンのスキッピングを誘導する化合物の同定は喫緊の課題である。そこで、これら１１のエクソンを対象としてミニ遺伝子を構築し、それらのスプライシングを一挙に解析できる高性能スプライシングアッセイ系を構築してきた。しかし、この系ではスプライシング産物をRT・PCR法により解析するため労力と費用を要した。本研究は、エクソンスキッピングしたmRNAを蛍光を用いて直接検出する高性能の方法の確立をはかるものである。
このスプライシングアッセイ系の実用性について証拠を得るために、候補となる化合物についてそのエクソンスキッピング誘導能を既確立のRT-PCR法により解析した。その結果、この系を用いることにより、エクソンスキッピング誘導能を有する化合物のみならず、スプライシングを抑制する化合物の同定が可能なことが判明した。現在、スプライシング抑制化合物を探索中である。
一方、細胞内に導入したミニ遺伝子から産生される標的mRNAの蛍光による検出については、標的となるRNAの人工合成、プローブとなるENA核酸配列の選択と合成などを行った。そして、検出のためのレーザー波長の検討、検出能の分析、検出システムの再構築などの検討を実施した。こうした蛍光検出系の基盤の整備を進め、蛍光検出システムの確立をはかってきたが、予想外に蛍光が弱く、システムの改良をはかっている。
本検出系を用いたスプライシングアッセイ系の有効性は確認されたので、本研究については今後も引き続き行い、早急にエクソンスキッピングしたジストロフィンmRNAの蛍光検出系を確立するものである。