機能性ナノ磁性微粒子を使用したエクソソームの抽出と解析

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K15502
• Research Institution: Kagoshima University
• Principal Investigator: 盛 真一郎 鹿児島大学, 医歯学域附属病院, 助教 (00620519)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 奥村 浩 鹿児島大学, 医歯学総合研究科, 客員研究員 (10398282) ; 前村 公成 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 准教授 (30398292) ; 喜多 芳昭 鹿児島大学, 医歯学域附属病院, 助教 (30570692) ; 馬場 研二 鹿児島大学, 附属病院, 医員 (30642615) ; 夏越 祥次 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 教授 (70237577)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: エクソソーム / 大腸癌幹細胞 / EMT / miRNA / ナノ磁気ビーズ

Outline of Annual Research Achievements

①HCT116，HCT15，COLO201，COLO205の大腸癌細胞株を購入し，培養を行った．培養細胞の上澄み液を回収し，フィルターを使用し，エクソソームを回収し，内包されているタンパク質を解析した．⇒結果，タンパク質が抽出され，エクソソームが回収できることを確認したが，再現性がなく，エクソソーム回収実験を再度模索した．
②エクソソーム回収：ExoQuickを使用し回収したところ，効率よく回収可能であった．細胞培養の上澄みを3,000×gで15分間遠心分離し，上清を滅菌チューブに移し，ExoQuickを加え，4℃で静置する． 1,500×gで30分間遠心分離し，ペレットとして沈殿するものの上清を吸引除去する．1,500×gで5分間遠心分離後，残った上清を吸引除去する．滅菌蒸留水を加えて，エクソソームを溶解させる．電子顕微鏡：分離したエクソソームを再懸濁し，懸濁液をパラフィルム上に2-3滴置き，さらにエクソソームの液滴上にフォルムバー/カーボンコートEMグリッド をコート面が接するように置く．グリッド膜にエクソソームを10分間吸着させ，パラフィルム上に20μlの洗浄バッファーを滴下する．グリッド膜を洗浄バッファーの液滴上に置き，30秒間洗浄し，これを繰り返す．パラフィルム上に10μｌのEM溶液を滴下し， 10分間する．洗浄後，コート面を上向きにした状態でグリッド膜をろ紙に移し，そのまま室温で一晩乾燥させ，透過型電子顕微鏡下でエクソソームを観察する．本方法により，回収したエクソソームを電子顕微鏡で確認した．
③多摩川精機株式会社の受託サービスに依頼し，FGビーズにエクソソームの表面膜たんぱく質であるCD9，CD63，CD147の3種類のリガンドの固定化を再度行った．
④CD9は固定が安定せず，免疫沈降反応ができなかった．

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

エクソソーム回収の再現性がなく，振り出しに戻る形となった．フィルター濃縮を模索したところ，効率的に回収できることを確認した．

Strategy for Future Research Activity

①フィルターで濃縮したエクソソームを使用し，CD63，CD147を用い，特定のエクソソームが回収できるか，実験予定である．
②IRBの承認を経て，昨年5月より，臨床検体の血清を回収している．手技が安定したところで解析を行っていく