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2017 Fiscal Year Annual Research Report

Exosome extraction from supernatant using Functional nanomagnetic fine particles

Research Project

Project/Area Number 15K15502
Research InstitutionKagoshima University

Principal Investigator

盛 真一郎  鹿児島大学, 医歯学域附属病院, 助教 (00620519)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 奥村 浩  鹿児島大学, 医学部・歯学部附属病院, 助教 (10398282)
前村 公成  鹿児島大学, 医学部・歯学部附属病院, 准教授 (30398292)
喜多 芳昭  鹿児島大学, 医学部・歯学部附属病院, 助教 (30570692)
馬場 研二  鹿児島大学, 附属病院, 医員 (30642615) [Withdrawn]
夏越 祥次  鹿児島大学, 医歯学域医学系, 教授 (70237577)
Project Period (FY) 2015-04-01 – 2018-03-31
Keywordsエクソソーム / 大腸癌幹細胞 / EMT / miRNA / ナノ磁気ビーズ
Outline of Annual Research Achievements

大腸癌細胞株HCT116が実際にエクソソームを分泌しているかどうか確認するため,上清を回収し,電子顕微鏡で確認した.
①HCT116をRPMI1640+10%FBS培養液にて培養し,FBSフリーとし24h培養し,上層液を回収する.②4℃,2000g×10分で遠心し,上層液を回収する.③回収した上清5mlにExoQuick 1mlを加え,転倒混和(4回),4℃でovernight,4℃・1500g×30分で遠心し,上清を除去し,更に残った上清を除去する為に4℃,1500g×5分で遠心し,可及的に上清を取り除く.ペレットにPBS100µlを加えて懸濁し、1.5ml低タンパク吸着チューブへ移し,電子顕微鏡へ移行する.④電子顕微鏡操作:サンプルを膜張グリッド上に載せ10分静置,サンプル量とほぼ同量の2%リンタングステン水溶液を垂らし,サンプルを落とすパラフィルム上に2%リンタングステン水溶液を2つ用意し,グリッドを接触1sec×2ろ紙で余分な染色剤を吸収し,自然乾燥させ観察する.
【結果と考察】今回,ExoQuickを使用した結果,大腸癌細胞株HCT116から抽出されたエクソソームを電子顕微鏡で確認可能であった.エクソソームをいかに効率よく回収するかが課題であるが,ExoQuickは効率よくエクソソームを回収できるツールのひとつであることがわかった.
次に臨床検体を使用し,血清中のエクソソーム回収を試みた.同様にExoQuickを使用し回収したが,不純物が多く抽出された.今後,血清中のエクソソーム回収の精度を上げていく必要がある.血清中のエクソソーム回収の手技が安定したらエクソソーム内のmiRNA,mRNA,DNA,タンパク質などを解析していく.

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Published: 2018-12-17  

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