Exosome extraction from supernatant using Functional nanomagnetic fine particles

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15K15502
• Research Institution: Kagoshima University
• Principal Investigator: 盛 真一郎 鹿児島大学, 医歯学域附属病院, 助教 (00620519)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 奥村 浩 鹿児島大学, 医学部・歯学部附属病院, 助教 (10398282) ; 前村 公成 鹿児島大学, 医学部・歯学部附属病院, 准教授 (30398292) ; 喜多 芳昭 鹿児島大学, 医学部・歯学部附属病院, 助教 (30570692) ; 馬場 研二 鹿児島大学, 附属病院, 医員 (30642615) [Withdrawn] ; 夏越 祥次 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 教授 (70237577)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: エクソソーム / 大腸癌幹細胞 / EMT / miRNA / ナノ磁気ビーズ

Outline of Annual Research Achievements

大腸癌細胞株HCT116が実際にエクソソームを分泌しているかどうか確認するため，上清を回収し，電子顕微鏡で確認した．
①HCT116をRPMI1640+10%FBS培養液にて培養し，FBSフリーとし24h培養し，上層液を回収する．②4℃，2000g×10分で遠心し，上層液を回収する．③回収した上清5mlにExoQuick 1mlを加え，転倒混和（4回），4℃でovernight，4℃・1500g×30分で遠心し，上清を除去し，更に残った上清を除去する為に4℃，1500g×5分で遠心し，可及的に上清を取り除く．ペレットにPBS100µlを加えて懸濁し、1.5ml低タンパク吸着チューブへ移し，電子顕微鏡へ移行する．④電子顕微鏡操作：サンプルを膜張グリッド上に載せ10分静置，サンプル量とほぼ同量の2％リンタングステン水溶液を垂らし，サンプルを落とすパラフィルム上に2％リンタングステン水溶液を2つ用意し，グリッドを接触1sec×2ろ紙で余分な染色剤を吸収し，自然乾燥させ観察する．
【結果と考察】今回，ExoQuickを使用した結果，大腸癌細胞株HCT116から抽出されたエクソソームを電子顕微鏡で確認可能であった．エクソソームをいかに効率よく回収するかが課題であるが，ExoQuickは効率よくエクソソームを回収できるツールのひとつであることがわかった．
次に臨床検体を使用し，血清中のエクソソーム回収を試みた．同様にExoQuickを使用し回収したが，不純物が多く抽出された．今後，血清中のエクソソーム回収の精度を上げていく必要がある．血清中のエクソソーム回収の手技が安定したらエクソソーム内のmiRNA，mRNA，DNA，タンパク質などを解析していく．