2015 Fiscal Year Research-status Report
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15K15539
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
篠村 多摩之 東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 准教授 (70206118)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 軟骨細胞 / 脱分化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
当初の計画通り、まずはSwarm rat chondrosarcoma由来の軟骨様細胞に、プラスミドベクター、pC2Exp-βgal を遺伝子導入して強制的に脱分化を誘導し、線維芽細胞様の細胞からなるコロニーの単離を行った。尚、目的とするコロニーの出現頻度は極めて低かったので、遺伝子導入実験を繰り返して行い、計１０クローンを単離した。
次にそれぞれのクローンに於けるプラスミドDNAの挿入位置を明らかにするため、特定のクローンについて次世代シークエンサーによる解析を行った。しかし結果は予想に反して曖昧で、ベクターDNAの挿入位置は確定できなかった。そこで同じクローンについて、新たに DNA Walking 法による解析を試みたところ、上手くいくことが分かったので、残りの全てのクローンについても解析を行った。その結果、３クローンについてはベクターDNAの挿入位置が確定でき、４クローンについてはベクターの挿入部位がゲノムDNAの繰り返し配列部位であったため、挿入部位の正確な確定にまでは至らなかった。また残りの３クローンについては、解析に必要な制限酵素の適切なものが見つからず、結果は得られていない。
以上の結果を踏まえ、取り敢えずベクターDNAの挿入位置が確定できた３クローンについて、更に解析を進めた。その結果、ベクターDNAの挿入部位近傍のゲノム情報から、３クローンは全く異なった部位にベクターDNAが挿入されたものであることが解ったが、その一方で３クローンとも挿入部位近傍に長鎖ノンコーディングRNA (lncRNA) をコードする遺伝子が存在することが解った。しかしいずれの lncRNA もその機能は未知であり、現在その解析を進めているところである。尚、こうした解析は lncRNA の新たな機能の発見に繋がる可能性もあり、その重要性は大きいものと考えている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初の予想に反し、ベクターDNAの挿入部位近傍に存在していた遺伝子は、全て長鎖ノンコーディング RNA をコードしている機能未知の遺伝子であった。そのため転写産物に関する情報も、またその機能に関する情報も依然として不完全な状況にあり、まずは一次転写産物の同定とその解析を進める必要に迫られている。
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| Strategy for Future Research Activity |
当面の課題である長鎖ノンコーディングRNAの一次転写産物に関する情報が得られた時点で、当初の予定通り次の２点について解析を進める。 ①.定量的 RT-PCR 法により、元々の RCS 細胞と脱分化した RCS 細胞の間で、対象とする長鎖ノンコーディングRNAの発現レベルに差があるのかどうか調べる。 ②.それぞれの長鎖ノンコーディング RNAに対応するcDNAをRCS細胞で強制発現させ、脱分化が誘導されるかどうか調べる。こうした解析を通して、まずは軟骨細胞の脱分化が誘導される最初のステップを明らかにしていく。その上で、異なったクローン間での脱分化過程について比較解析を進め、共通項を明らかにすることで軟骨細胞の脱分化過程の分子機構を明らかにしていく。
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| Causes of Carryover |
年度末に注文した一部の試薬が、年度末キャンペーンの対象商品となったことで、次年度使用額が生じてしまいました。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度使用額は少額ではありますが大切な助成金ですので、平成28年度の助成金と合わせて有効に使用いたします。
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