2016 Fiscal Year Annual Research Report
Elucidation of molecular mechanism underlying chondrocyte dedifferentiation
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15K15539
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
篠村 多摩之 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 准教授 (70206118)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 軟骨細胞 / 脱分化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
前年度に引き続き、プラスミドベクターの挿入位置が確定できた３クローンについて、更に詳細な解析を進めた。その結果３クローンとも、ベクターDNAの挿入部位に内在性の遺伝子は一切存在していないことが分かった。従って、プラスミドDNAが挿入されたことによって起こる遺伝子の破壊が、脱分化の原因とは考え難い。そこで次にDNA の挿入に伴う周辺遺伝子の活性化が、脱分化の原因である可能性について検討を加えた。まず、プラスミドDNAの挿入部位近傍（約100 kb）に存在する全ての遺伝子について、RCS細胞での発現をRT-PCRで調べた。その上で、RCS細胞で発現が認められなかった遺伝子について強制発現を試みたが、RCS細胞の脱分化は誘導できなかった。
ところで、プラスミドDNAを細胞に導入して安定発現細胞株を樹立する場合、DNAは染色体の複数箇所に同時に挿入されるケースが多いとの報告がある。このことが正しいとすると、上述した解析において、プラスミドDNAの挿入部位が全て確定できていなかった可能性が高くなる。そこで、こうした不確定な要素を除外する為に、当初の計画を一部変更して、プラスミドベクターに代わりレトロウイルスベクターを用いて脱分化が誘導できるかどうか調べた。まずプラスミドベクター、pC2Exp-bgalに様々な修飾を加え、幾つかレトロウイルスベクターを構築してRCS細胞に感染させた。その結果、rvbgal-bsdと名付けたウイルスベクターを用いた場合のみ、非常に高率にRCS細胞の脱分化を誘導できることが分かった。そこで現在、１細胞あたり１つのウイルスが感染するようにウイルスタイターを調整した上で実験を進めている。従って今後は、レトロウイルスの挿入位置を確定することで、脱分化の分子機構について有用な情報が得られるものと確信している。
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