2016 Fiscal Year Research-status Report
ドラッグリポジショニング戦略による進行性骨化性線維異形成症治療薬の開発
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15K15548
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
鬼頭 浩史 名古屋大学, 医学系研究科, 准教授 (40291174)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
杉浦 洋 名古屋大学, 医学部附属病院, 医員 (40750477)
松下 雅樹 名古屋大学, 医学部附属病院, 病院助教 (60721115)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 進行性骨化性線維異形成症 / ALK2 / Id1 / 薬効スクリーニング / ドラッグ・リポジショニング / 異所性骨化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
進行性骨化性線維異形成症（fibrodysplasia ossificans progressiva : FOP）は骨形成タンパク（bone morphogenetic protein : BMP）の受容体であるALK2の活性型変異により発症し、全身の軟部組織に進行性の異所性骨化をきたす難病である。異所性骨化は外傷や手術侵襲などで急激に増悪するため、外科的治療の適応はなく、むしろ禁忌とされている。また、進行性の骨化を抑制する有効な内科的治療法もない。我々は変異型ALK2強制発現ベクターおよびBMPシグナルの標的遺伝子であるId1プロモーターのレポーターベクターをマウス筋芽細胞株C2C12に導入して、ルシフェラーゼ活性にて薬効スクリーニングする系を確立した。この系に1186種類の米国食品医薬品局既認可化合物のライブラリーを添加し、ルシフェラーゼ活性を減弱させる既存薬を網羅的に検索した。ファーストスクリーニングにてカットオフ値をvehcle比0.3以下とし、抗がん剤や抗生剤、免疫抑制剤など長期投与が困難な薬剤を除外してセカンドスクリーニングを行った。細胞増殖能の低下に基づくルシフェラーゼ活性の低下をルールアウトするため、MTSアッセイにより細胞増殖能も併せて評価した。セカンドスクリーニングにてカットオフ値0.2以下にルシフェラーゼ活性を下げた15種類（抗うつ薬4種類、抗ヒスタミン薬3種類、抗精神病薬3種類、高血圧薬、抗リウマチ薬、高脂血症薬、骨粗鬆症薬、セロトニン作動薬それぞれ1種類）の候補薬剤を絞り込んだ。現在、サードスクリーニングにてこれら薬剤の濃度度依存性の薬効を検討中である。本研究ではドラッグ・リポジショニング戦略に基づいた既存薬の網羅的スクリーニングにより、Id1プロモーター活性を抑制してFOPの異所性骨化を抑制する薬剤を同定することを目的とする。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
前年度までにC2C12細胞に変異型ALK2ベクター、レニーラ・ルシフェラーゼベクターおよびId1プロモータールシフェラーゼベクターを遺伝子導入したスクリーニング系を確立し、セカンドスクリーニングまで実施して候補薬を絞り込んだ。しかし、それら薬剤に対しサードスクリーニングで濃度依存性の薬効を検討したところ、ルシフェラーゼ活性では充分な濃度依存性を証明することができなかった。そこで、今年度にセカンドスクリーニングを再度施行し、新たな候補薬15種類を同定した。スクリーニングの再検を行ったことにより、当初の予定よりやや遅れていると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
新たに同定した15種類の薬剤に対し、サードスクリーニングにて濃度依存性の薬効を検討する。濃度依存性の評価はルシフェラーゼ活性だけでなく、Id1のmRNAの発現をRT-PCR法で、Id1タンパクの発現をWestern blotting法にて評価する。また、Id1の標的遺伝子である各種骨形成マーカー（アルカリフォスファターゼ、オステオカルシン、オステオポンチンなど）のmRNAおよびタンパク発現の検討も加える。さらに、BMPシグナル下流の細胞内SMAD1/5/8のリン酸化抑制作用に関しても評価する。これら実験により、in vitroでの有効性を示す薬剤をさらに絞り込み（理想的には1-3種類）、動物モデル（FOPモデル動物あるいはcrude BMPの筋肉内移植による異所性骨化モデル）に投与して、in vivoにおける骨形成抑制作用を検討する。
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| Causes of Carryover |
当初は28年度内にサードスクリーニングを実施する予定であったが、薬剤の絞り込みが年度内に完了しなかった。したがって、サードスクリーニングで薬剤濃度依存性を検討するためのRT-PCR、Western blotting、ELISAの実施が予定通りに進まなかったため、次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
15種類の薬剤に対し、Id1のmRNA発現をRT-PCR法で、タンパク発現をWestern blotting法で評価する。また、各種骨形成マーカー（アルカリフォスファターゼ、オステオカルシン、オステオポンチンなど）のmRNAおよびタンパク発現の検討も加える。さらに、細胞内Smad1/5/8のリン酸化抑制作用を検討する。
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[Journal Article] Characterization of novel Runx2 mutation with alanine tract expansion from Japanese cleidocranial dysplasia patient2016
Author(s)
Shibata A, Machida J, Yamaguchi S, Kimura M, Tatematsu T, Miyachi H, Matsushita M, Kitoh H, Ishiguro N, Nakayama A, Higashi Y, Shimozato K, Tokita Y
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Journal Title
Mutagenesis
Volume: 31
Pages: 61-67
DOI
Peer Reviewed
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[Presentation] Genu varum in achondroplasia and hypochondroplasia2016
Author(s)
Hiroshi Kitoh, Kenichi Mishima, Masaki Matsushita. Hiroshi Sugiura, Sachi Hasegawa, Naoki Ishiguro
Organizer
Annual meeting of Pediatric Orthopedic Society of North America
Place of Presentation
Indianapolis （ＵＳＡ）
Year and Date
2016-04-27 – 2016-04-30
Int'l Joint Research
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