Functional analyses of mutant NLRP3 on the growth and differentiation of growth plate chondrocytes

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15K15549
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 戸口田 淳也 京都大学, ウイルス・再生医科学研究所, 教授 (40273502)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 池谷 真 京都大学, iPS細胞研究所, 准教授 (20442923) ; 金 永輝 京都大学, 医学研究科, 特定助教 (90620344)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: CINCA症候群 / NLRP3 / 成長板軟骨細胞 / 細胞間相互作用

Outline of Annual Research Achievements

１．平成27年度に樹立した変異陰性及び変異陽性CINCA-iPS細胞にそれぞれ、GFP及びmCherry遺伝子を発現するベクターをAAVS1遺伝子座に導入した細胞を用いて、それぞれを軟骨細胞に分化誘導した。誘導後も蛍光遺伝子の発現が維持されることを確認できた。
２．標識した変異陰性及び変異陽性CINCA-iPS細胞を、これまでに確立した神経堤を経る培養法により軟骨前駆細胞へ分化誘導し、その後に両者をいくつかの比率で混合した細胞集団を作製し、3Ｄの軟骨分化誘導実験を行った。その結果、変異細胞を少数混合した場合でも、変異細胞のみのものと細胞塊のサイズは同等となることが判明し、細胞間相互作用が存在している可能性を示唆する結果が得られた。
２．標識した変異陽性および陰性iPS細胞を、軟骨前駆細胞へ分化誘導した後、連携研究者が開発した培地共有培養装置を用いてフィルターで隔別されたwellに細胞を播種した後に、2Dの軟骨分化誘導実験を行った。その結果、正常細胞の遺伝子発現等の軟骨分化が亢進している結果が得られ、変異細胞からの液性因子の影響を示唆する結果が得られた。
３．平成27年度の研究から、モザイク患者における正常細胞由来iPS細胞と変異細胞由来iPS細胞の機能を比較検討する際における、それぞれの細胞のクローン間の相違が顕著であるために、変異の有無による影響を正確に評価することが困難であることが判明した。そこでゲノム編集技術を用いて患者由来正常iPS細胞に変異を導入した細胞を用いる方針に変更し、その細胞の作製を行った。また同時に標準的iPS細胞に、CINCA症候群で観察される複数の変異を、それぞれ導入した細胞を作製した。

Research Products

• [Journal Article] BMP-SMAD-ID promotes reprogramming to pluripotency by inhibiting p16/INK4A-dependent senescence (2016)
  • Author(s): Hayashi, Y., Hsiao, EC., Sami, S., Lancero, M., Schlieve, CR., Nguyen, T., Yano, K., Nagahashi, A., Ikeya, M., Matsumoto, Y., Nishimura, K., Fukuda, A., Hisatake, K., Tomoda, K., Asaka, I., Toguchida, J., Conklin, BR., and Yamanaka, S
  • Journal Title: Proc. Natl. Acad. Sci. U S A Volume: 113 Pages: 13057-13062
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Presentation] iPS細胞由来軟骨細胞とバイオ3Dプリンタを用いた立体的軟骨構造体の作製 (2016)
  • Author(s): 田中麻衣、薦田博、長池碧、永田早苗、戸口田淳也、中山功一
  • Organizer: 第31回日本整形外科学会基礎学術集会
  • Place of Presentation: 福岡国際会議場（福岡県福岡市）
  • Year and Date: 2016-10-13 – 2016-10-14
• [Presentation] 疾患特異的iPS細胞を活用した骨格疾患の病態解明 (2016)
  • Author(s): 戸口田淳也、日野恭介、池谷真、関口和也、金永輝、岡本健、吉富啓之、松田秀一
  • Organizer: 第31回日本整形外科学会基礎学術集会
  • Place of Presentation: 福岡国際会議場（福岡県福岡市）
  • Year and Date: 2016-10-13 – 2016-10-14
  • Invited
• [Presentation] Investigation of molecular mechanism underlying enhanced chondrogenesis in neonatal-onset multisystem inflammatory disease using patient-derived induced pluripotent stem cells. (2016)
  • Author(s): Tamaki, S., Watanabe, M., Yamamoto, R., Yoshitomi, H., Nishikomori, R., and Toguchida, J.
  • Organizer: ISSCR 2016 Annual Meeting
  • Place of Presentation: San Francisco（USA）
  • Year and Date: 2016-06-22 – 2016-06-25
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 疾患特異的iPS細胞を用いた創薬に向けた薬剤スクリーニング系の構築 (2016)
  • Author(s): 松本佳久、池谷真、日野恭介、福田誠、大塚隆信、戸口田淳也
  • Organizer: 第89回日本整形外科学会学術総会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • Year and Date: 2016-05-12 – 2016-05-15