2015 Fiscal Year Research-status Report
革新的イメージングとKOマウスを駆使した骨代謝におけるArkadiaの機能解析
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15K15553
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| Research Institution | Ehime University |
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Principal Investigator |
今村 健志 愛媛大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (70264421)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | バイオテクノロジー / シグンル伝達 / 遺伝子 / タンパク質 / 細胞・組織 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
最先端の分子生物学的手法、細胞生物学的手法と申請者自らが開発した多光子励起顕微鏡を用いた革新的生体蛍光イメージング法を駆使し、BMPシグナルを制御するE3 ユビキチンリガーゼArkadia の骨芽細胞分化における時空間的な役割・作用点とその分子メカニズムを明らかにし、新たな骨粗鬆症の治療薬へ繋がる基礎的知見を得ることを目的に研究を行った。
まず、平成27年度は、Arkadia を制御するcofactor を同定し、その分子メカニズムを解明することを目的に、Arkadia 結合タンパク質のスクリーニングを行い、その機能解析のために基盤整備を行った。具体的には、293 細胞にFLAG-tag のついた野生型Arkadia とリガーゼ活性を喪失した変異型Arkadia の遺伝子を導入し、免疫沈降後に、質量分析法を用いてArkadia 結合タンパク質をスクリーニングした結果から、候補タンパク質の選別し、そのドメインや機能を考慮して、FLAGと6xMycなどのepitope-tag付きタンパク質用のプラスミドのコンストラクションを開始した。
in vivoの先進的遺伝子改変マウスを用いた実験については、単純なArkadia KO マウスは胎生致死なので、Cre-lox コンディショナルノックアウト法を利用したArkadia に対する骨特異的ノックアウトマウスの作製が必要であるが、すでに作製済みのhypomorphic phenotypeのArkadia floxマウスの解析を先行させるために、そのgenotyping等の準備を行った。一方で、Arkadia floxマウスのデザインを完了した。
さらに、BMP シグナルのイメージングのために、BMP 特異的プロモーターの下流で蛍光タンパク質が発現するTgマウスのデザインを完了した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
最先端の分子生物学的手法および細胞生物学的手法に関しては、Arkadia 結合タンパク質のスクリーニングとArkadia を制御するcofactorの候補タンパク質の選別が終了しそのドメインや機能を考慮した候補タンパク質のFLAGと6xMycなどのepitope-tag付きタンパク質用のプラスミドのデザインとコンストラクションに着手し、タンパク質の機能解析のための基盤整備は順調に進展している。
in vivoの先進的遺伝子改変マウスを用いた実験については、Arkadia floxマウスの作製のためのデザインは完了し、掛け合わせるための骨芽細胞特異的ColI-Cre トランスジェニックマウス（ColI-Cre Tgマウス）は入手した。さらに両者のgenotyping等の条件設定は完了した。一方で、すでに作製済みのhypomorphic phenotypeのArkadia floxマウスの解析を先行させるための基礎実験に着手し、in vivoのための基盤整備は順調に進展している。
さらに、BMP シグナルのイメージングのために、BMP 特異的プロモーターの下流で蛍光タンパク質が発現するTgマウスのデザインは完了した。具体的には、BMP 標的遺伝子であるID1 のプロモーターのBMP responsive element (BRE)の下流にGFP遺伝子を繋げたプロモーターレポーターを設計した。
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| Strategy for Future Research Activity |
最先端の分子生物学的手法、細胞生物学的手法と申請者自らが開発した多光子励起顕微鏡を用いた革新的生体蛍光イメージング法を駆使し、BMPシグナルを制御するE3 ユビキチンリガーゼArkadia の骨芽細胞分化における時空間的な役割・作用点とその分子メカニズムを明らかにし、新たな骨粗鬆症の治療薬へ繋がる基礎的知見を得ることを目的に今後も研究を進める。
まず、Arkadia を制御するcofactorに関しては、FLAGと6xMycなどのepitope-tag付き候補タンパク質用のプラスミドをCOS7 細胞に強制発現またはshRNA によってノックダウンし、Arkadia とSmad6 の結合、Arkadia によるSmad6 のユビキチン化・分解、Arkadia によるBMP の転写制御に対する効果を解析し、cofactor 候補分子を同定する予定である。
次に、in vivoの先進的遺伝子改変マウスを用いた実験については、hypomorphic phenotypeのArkadia floxマウスの解析を先行させるとともに、Arkadia floxマウスの作製、骨芽細胞特異的ColI-Cre トランスジェニックマウス（ColI-Cre Tgマウス）との掛け合わせを進める。
さらに、BMP シグナルのイメージングのために、BMP 特異的プロモーターの下流で蛍光タンパク質が発現するTgマウスのデザインを完了したので、今後は、BMP 標的遺伝子であるID1 のプロモーターのBMP responsive element (BRE)の下流にGFP遺伝子を繋げたプロモーターレポーターを作製し、Tgマウス作製を進める。
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| Causes of Carryover |
比較的費用がかからないin vitroにおけるArkadia 結合タンパク質のスクリーニングを精力的に進め、比較的費用がかかるin vivo実験については、既存のhypomorphic phenotypeのArkadia floxマウスの解析を先行させ、さらに比較的費用がかからないマウス作製における実験条件設定など基礎基盤の整備を完了した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
整備された実験条件設定など基礎基盤にもとづき、比較的費用がかかるマウス作製・維持などin vivo実験について精力的に研究を進める。
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